Descriviamo un’originale piattaforma di analisi del RNA di trasferimento denominata SPOt (snella piattaforma per l’osservazione del tRNA). Punto misura contemporaneamente i livelli cellulari di tutti i tRNAs nei campioni biologici, in solo tre passi e in meno di 24 ore.
RNA transfer (tRNA) sono abbondanti breve non codificanti RNA specie che sono in genere da 76 a 90 nucleotidi di lunghezza. tRNAs sono direttamente responsabili per la sintesi proteica, traducendo i codoni del mRNA in sequenze dell’amminoacido. tRNAs lungo sono stati considerati come molecole di mantenimento della casa che mancava funzioni di regolamentazione. Tuttavia, un corpo crescente di prova indica che i livelli cellulari di tRNA fluttuano in corrispondenza di condizioni variabili come il tipo di cella, l’ambiente e lo stress. La fluttuazione dell’espressione di tRNA condiziona direttamente la traduzione genica, favorendo o reprimere l’espressione delle proteine particolari. In ultima analisi, comprendere la dinamica della sintesi proteica richiede lo sviluppo di metodi in grado di fornire profili di tRNA di alta qualità. Il metodo che presentiamo qui è denominato SPOt, che sta per piattaforma semplificata per Observing tRNA. SPOt è costituito da tre passaggi a partire con l’etichettatura metabolica delle colture cellulari con ortofosfato radioattivo, seguita da guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio estrazione di RNA totale radioattivo e infine l’ibridazione su in-House stampati macroarrays. livelli di tRNA sono stimati di quantificare l’intensità di radioattività ad ogni spot di sonda. In protocollo presentato qui noi profilo tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, un batterio non patogeno, spesso usato come organismo modello per studiare la tubercolosi.
I livelli cellulari di tRNA fluttuano secondo condizioni come tipo di cella, ambiente e stress1,2,3. SPOt, snella piattaforma per l’osservazione di tRNA, è un originale, affidabile e semplice tecnica che permette la rapida e precisa quantificazione dei livelli di RNA di trasferimento negli organismi coltivate in laboratorio.
tRNAs hanno notevolmente stabili strutture secondarie e terziarie4. Essi mostrano anche numerose modificazioni post-trascrizionali5. Queste caratteristiche rappresentano strutturali significativi e blocchi stradali di sequenza polarizzazione o a volte impedire diretto e riproducibile tRNA profilatura mediante benchmark standard RNA quantificazione tecniche6. Gruppi di ricerca nel mondo sono stati costretti a sviluppare tecniche creative ma spesso contorte per valutare i livelli cellulari di tRNA. Alcuni di questi metodi includono: (1) separazione elettroforetica bidimensionale di metabolicamente con etichetta tRNAs combinato con assegnazione posto metodico di Northern blot1; (2) i singoli quantificazione mediante Northern blot utilizzando sonde DNA radioattivo accuratamente standardizzate7; (3) post-estrazione etichettatura con fluorocromi cianina seguita da microarray analysis3e (4) in vitro stripping di modifiche di tRNA utilizzando enzimi ricombinanti demodification combinati con trascrizione d’inversione e successivi sequenziamento High8.
SPOt è una combinazione semplice e originale di due approcci standard e semplice: corpo (1) RNA etichettatura, che consiste nella sintesi, nella coltivazione di organismi, di RNA totale radioattivo e (2) tRNA macroarrays, strumento di genomico sistematico e miniaturizzato ottimizzato per la segregazione di tRNA.
I campioni sono semplificati da organismi viventi per la piattaforma di quantificazione. Essi sono analizzati direttamente dopo l’estrazione e non elaborato qualsiasi ulteriore che limita notevolmente le distorsioni rispetto alle tecniche che richiedono l’amplificazione dell’alberino-estrazione o trattamenti enzimatici. SPOt è versatile e può essere facilmente combinato al frazionamento polisoma per identificare e quantificare le sottopopolazioni di tRNA che sono fisicamente associate con la traduzione di ribosomi.
Il protocollo presentato qui è ottimizzato per Mycobacterium smegmatis, ed è stato usato con successo anche per profilo tRNAs9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, mouse e colture di cellule umane11 .
Le emissioni di particelle beta sono noti agenti batteriostatici e battericidi14, tuttavia radiazioni nella gamma testata non hanno alcun impatto significativo sull’adeguatezza della cella. Conteggio delle scintillazioni ha mostrato che la radioattività è incorporata nel 25% del totale-cella estratti e successivamente, l’1% di RNA totale purificato.
Delle sonde identiche dimensioni, temperatura di fusione comparabile e contenuto di GC, insieme a un protocollo uniforme per macroarray spotting, ibridazione e quantificazione permette imparziale misura dei livelli di tRNA direttamente dai segnali spot.
SPOt è riproducibile e specifici. Sua grande gamma dinamica e la soglia facilmente regolabile permette di profilatura basso specie abbondanti, come tRNAs associato polisomi, semplicemente prolungando la matrice esposizione volte9. Dopo l’investimento iniziale per l’attrezzatura necessaria, il costo per campione, compresi materiali di consumo, di funzionamento media $15 a campioni.
SPOt è applicabile a qualsiasi organismo cui genoma è disponibile per il design della sonda. Organismi di modello che vengono coltivati in vitro sono candidati ideali per l’etichettatura metabolica. Come il genoma di mammiferi spesso codifica molti isodecoders (tRNAs che condividono identici anticodoni ma visualizzare piccole differenze nelle loro sequenze di corpo) sonde devono essere parzialmente degenerati per mantenere omogenea ibridazione delle specie di tRNA stretta. Infine, le cellule di mammiferi aderente producono in genere minori quantità di RNA totale rispetto agli organismi coltivati in sospensione come M. smegmatis, quindi le colture devono essere sostanzialmente scalato.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da un grant SC INBRE dal National Institute of General Medical Science – NIH (P20GM103499 di R.G.) e concede CA555536 & CA154664 dal National Cancer Institute a P.H.H. Questo programma è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per il College of Charleston l’Howard Hughes Medical Institute attraverso il pre-college & programma di educazione scientifica dello studente non laureato e da sovvenzioni dal centro nazionale per ricerca risorse (5 P20 RR016461) e il National Institute of General Medical Sciences (P20 8 GM103499) da istituti nazionali di salute.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |