우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.
전송 RNAs (tRNA)는 풍부한 짧은 비 코딩 RNA 종 일반적으로 76 ~ 90 뉴클레오티드 길이에서. tRNAs는 codons mRNA에 아미노산으로 변환 하 여 직접 단백질 합성에 대 한 책임이 있습니다. tRNAs 했다 긴 집 유지 분자 규제 기능 부족으로 간주 됩니다. 그러나, 증거의 성장 몸은 셀룰러 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스 등 다양 한 조건에 대응에 변동 나타냅니다. TRNA 식의 변동 진 번역을, 선호 또는 특정 단백질의 식을 억압에 직접 영향을 줍니다. 궁극적으로 단백질 합성의 동적 이해 높은-품질 tRNA 프로필을 제공할 수 있는 방법의 개발을 필요 합니다. 우리가 여기에 제시 하는 방법 자리 관찰 tRNA를 위한 간소화 된 플랫폼에 대 한 의미 하는 이름입니다. 자리 방사성 orthophosphate, guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 방사성 총 RNAs의 뒤와 세포 배양의 대사 라벨로 시작 하는 3 단계 구성 하 고 마지막으로 사내에 교 잡 인쇄 macroarrays입니다. tRNA 레벨은 각 조사 현장에서 방사능 농도 측정 하 여 견적 된다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리는 진 균 smegmatis mc2155, 결핵 연구에 모델 생물으로 자주 사용 nonpathogenic 박테리아에에서 tRNAs 프로필입니다.
세포질 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스1,2,3등 조건에 따라 변동. 자리, tRNA, 관찰을 위한 효율적인 플랫폼 이며 원본, 신뢰할 수 있는, 실험실 성장 유기 체에서 전송 RNA 레벨의 신속 하 고 정확한 정량화를 허용 하는 간단 기술.
tRNAs 있다 현저 하 게 안정 된 2 차 및 3 차 구조4. 그들은 또한 수많은 post-transcriptional 수정5를 표시합니다. 이러한 기능은 중요 한 구조 및 시퀀스 검문소 바이어 싱 또는 때로는 직접적이 고 재현 tRNA 표준 벤치 마크 RNA 정량화 기법6을 사용 하 여 프로 파일링 방지를 나타냅니다. 전 세계 연구 단체 세포질 tRNA 수준을 평가 하 창조적인 하지만 종종 복잡 한 기술을 개발 하도록 강요 했다. 이러한 방법 중 일부를 포함: (1) 2 차원 전기 이동 별거 metabolically 레이블이 tRNAs의 조직적 자리 배정 북부 오 점1;에 의해 결합 (북부 여 2) 개별 정량화 되 신중 하 게 표준화 된 방사성 DNA 프로브7;를 사용 하 여 리 (microarray 분석3, 그리고 (4) 생체 외에서 의 tRNA 수정 반전 녹음 방송 결합 및 후속 재조합 demodification 효소를 사용 하 여 스트립 다음 cyanine 형광와 라벨 3) 게시물 추출 높 처리량 연속8.
자리는 2 개의 표준 및 간단 접근의 간단 하 고 원래의 조합: (1) RNA 몸, 성장 하는 유기 체, 방사성 총 RNAs tRNA (2) macroarrays, 체계적이 고 소형 게놈 도구의 합성에서으로 구성 된 tRNA 분리에 대 한 최적화.
샘플은 정량화 플랫폼에 살아있는 유기 체에서 간소화 됩니다. 그들은 직접 추출 후 분석 하 고 어떤 더 크게 증폭 후 추출 또는 효소 치료 기법에 비해 편견 제한 처리 되지 않습니다. 자리는 다양 하 고 식별 하 고 물리적으로 연결 된 리보솜 번역 tRNA 모집단 계량 polysome 분별에 쉽게 결합 될 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜은 진 균 smegmatis, 최적화 되어 있으며 그것은 또한 성공적으로 대장균9, Saccharomyces cerevisiae10, 마우스, 그리고 인간의 세포 배양11 프로필 tRNAs에 사용 되었다 .
그러나 베타 입자 배출 시험된 범위에 방사선 셀 체력에 큰 영향을 주지 않습니다 bacteriostatic 및 살 균 에이전트14,으로 알려져 있습니다. 섬광 계산 보여주었다 방사능의 총 세포 추출 물 25% 및 그 후, 정제 총 RNAs의 1%에 통합 됩니다.
프로브 동일한 크기, 비교 용융 온도 및 GC 콘텐츠, macroarray 안보에 대 한 균일 한 프로토콜 함께 교 잡 및 정량화 자리 신호에서 직접 tRNA 레벨의 편견된 측정에 대 한 수 있습니다.
재현할 수 및 특정입니다. 그것의 넓은 동적 범위와 쉽게 조정 가능한 임계값 낮은 풍부한 종, tRNAs 배열 노출 시간9연장 하면 polysomes, 연관 프로 파일링 수 있습니다. 필요한 장비에 대 한 초기 투자 후 샘플, 소모품를 포함 하 여 당 비용 실행 샘플 당 $15를 평균 한다.
자리는 누구의 게놈은 프로브 디자인에 사용할 수 있는 모든 유기 체에 적용 됩니다. 생체 외에서 재배 되는 모델 생물 대사 라벨에 대 한 이상적인 후보자 이다. 포유류 게놈 종종 많은 isodecoders (동일한 anticodons를 공유 하지만 그들의 몸 시퀀스에서 작은 차이 표시 tRNAs) 인코딩으로 프로브 가까운 tRNA의 동종 하이브리드를 보존 하기 위해 부분적으로 퇴 화 될 필요가 있다. 마지막으로, 부착 포유류 세포에 M. smegmatis, 같은 문화 실질적으로 확장 될 필요가 성장 하는 유기 체에 비해 총 RNA의 일반적으로 낮은 금액을 산출 한다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업을 지원 했다 사우스 캐롤라이나 INBRE 교부 금에서 국립 연구소의 종합 의료 과학-NIH에 의해 (립에 P20GM103499) 국립 암 연구소에서 P.H.H. CA555536 및 CA154664를 부여 이 프로그램 지원 부분에서 전 대학 & 학부 과학 교육 프로그램을 통해 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 차 알 스턴의 대학에 교부 금에 의해 그리고 국립 센터에서 교부 금에 의해 연구 자원 (P20 RR016461 5) 그리고 국립 연구소의 일반 의료 과학 (8 P20 GM103499) 건강의 국가 학회에서.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |