Nós descrevemos uma plataforma de análise de RNA de transferência original chamada SPOt (plataforma simplificada para observar o tRNA). Local simultaneamente mede níveis celulares de todos os tRNAs em amostras biológicas, em apenas três passos e em menos de 24 horas.
RNAs de transferência (tRNA) são curtos não-codificantes do RNA espécies abundantes que são tipicamente de 76 a 90 nucleotídeos de comprimento. os tRNAs são diretamente responsáveis pela síntese de proteínas, traduzindo códons de RNAm em sequências de aminoácidos. os tRNAs tempo foram considerados como moléculas de domésticas que faltava funções reguladoras. No entanto, um conjunto crescente de evidências indica que os níveis de tRNA celular flutuarem em correspondência com condições variáveis tais como o tipo de célula, ambiente e stress. A flutuação da expressão de tRNA influencia directamente a tradução do gene, favorecendo ou reprimindo a expressão de proteínas específicas. Em última análise, compreender a dinâmica da síntese de proteínas requer o desenvolvimento de métodos capazes de fornecer perfis de tRNA de alta qualidade. O método que apresentamos aqui é chamado SPOt, sigla para plataforma simplificada para Observing tRNA. Ponto consiste de três etapas, começando com rotulagem metabólico de culturas de células com ortofosfato radioactivo, seguido pela extração de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio de RNAs totais radioactivos e finalmente hibridação na in-house impressos macroarrays. níveis de tRNA são estimados por quantificar as intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda. No protocolo apresentado aqui nós perfil tRNAs em Mycobacterium smegmatis mc2155, uma bactéria não-patogênicas frequentemente usada como um organismo modelo para estudar a tuberculose.
Níveis de tRNA celular variam de acordo com condições tais como o tipo de célula, ambiente e stress1,2,3. SPOt, plataforma simplificada para observar o tRNA, é uma original, confiável e uma técnica simples que permite a rápida e precisa de quantificação dos níveis de RNA de transferência em organismos laboratório-crescido.
os tRNAs têm estruturas secundárias e terciárias notavelmente estável4. Eles também exibem numerosas modificações pós-transcricional5. Esses recursos representam significativa estrutural e bloqueios de estradas sequência de polarização ou às vezes impedindo direta e reprodutíveis tRNA perfis usando de técnicas de quantificação de RNA de referência padrão6. Grupos de pesquisa ao redor do mundo foram obrigados a desenvolver técnicas criativas, mas muitas vezes complicadas para avaliar níveis de tRNA celular. Alguns desses métodos incluem: (1) separação eletroforética bidimensional de tRNAs metabolicamente rotulado combinado com atribuição local metódica pelo Borrão do Norte1; (2) individual quantificação por Northern blot usando cuidadosamente padronizado radioativo DNA sondas7; (3) pós-extração de rotulagem com fluorochromes cianina seguido de análise de microarray3e (4) em vitro descascamento de modificações de tRNA usando enzimas recombinantes demodification combinadas com a transcrição reversa e subsequentes arranjar em sequência do elevado-throughput,8.
SPOt é uma combinação simples e original de duas abordagens de padrão e simples: corpo de RNA (1) rotulagem, que consiste na síntese, no cultivo de organismos, de RNAs totais radioactivos e (2) tRNA macroarrays, uma ferramenta genômica sistemática e miniaturizada otimizado para segregação de tRNA.
As amostras são simplificadas de organismos vivos para a plataforma de quantificação. Eles são analisados diretamente após a extração e não processados mais longe que limita significativamente a preconceitos em relação às técnicas que requerem amplificação pós-extração ou tratamentos enzimáticos. SPOt é versátil e pode ser facilmente combinado para fracionamento de polysome a identificação e quantificação de subpopulações de tRNA fisicamente associados traduzir ribossomas.
O protocolo aqui apresentado é otimizado para Mycobacterium smegmatis, e foi usado também com sucesso para os tRNAs perfil em9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, rato e culturas de células humanas11 .
Emissões de partículas beta são conhecidas agentes bactericidas e bacteriostáticas,14, no entanto, radiações na faixa testada não tem nenhum impacto significativo na aptidão de célula. Contagem de cintilação mostrou que a radioatividade é incorporada por 25% do total-célula extratos e, posteriormente, 1% do RNA total purificada.
Das sondas tamanhos idênticos, temperatura de fusão comparável e conteúdo GC, juntamente com um protocolo uniforme para macroarranjo manchando, hibridização e quantificação permite imparcial medição dos níveis de tRNA diretamente de sinais local.
SPOt é reprodutível e específicos. Seu grande alcance dinâmico e facilmente ajustável limiar permite a criação de perfil baixos espécies abundantes, tais como os tRNAs associados polissomos, simplesmente prolongando matriz exposição vezes9. Após o investimento inicial para o equipamento necessário, a execução, custo por amostra, incluindo consumíveis, média de US $15 por amostras.
SPOt é aplicável a qualquer organismo cujo genoma está disponível para o projeto da sonda. Organismos-modelo que são cultivados em vitro são candidatos ideais para a rotulagem metabólicos. Como genomas de mamíferos codificam frequentemente muitos isodecoders (os tRNAs que compartilham anticódons idênticos mas exibir pequenas diferenças em suas sequências de corpo) sondas precisam ser parcialmente degenerado para preservar homogênea hibridação de espécies perto do tRNA. Finalmente, células de mamíferos aderentes rendem normalmente menor quantidade de RNA total, em comparação com os organismos cultivados em suspensão tais como M. smegmatis, então culturas precisam ser substancialmente ampliados.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por um subsídio de SC INBRE do Instituto Nacional de General Medical ciência – NIH (P20GM103499 de R.G.) e concede a CA555536 & CA154664, do Instituto Nacional do câncer para P.H.H. Este programa foi apoiado em parte por uma concessão à Universidade de Charleston do Howard Hughes Medical Institute, através da pre-faculdade & graduação programa de educação científica e por concessões do centro nacional para recursos de pesquisa (5 P20 RR016461) e o Instituto Nacional de General Medical Ciências (P20 8 GM103499) dos institutos nacionais de saúde.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |