Vi beskriver en ursprungliga överföring RNA analysplattform heter SPOt (strömlinjeformad plattform för observation tRNA). SPOt samtidigt åtgärder cellulära nivåer av alla tRNAs i biologiska prover, i bara tre steg och i mindre än 24 timmar.
Överföring RNA (tRNA) är rikligt kort icke-kodande RNA arter som vanligtvis 76 till 90 nukleotider i längd. tRNAsna är direkt ansvariga för proteinsyntes genom att översätta kodon i mRNA in i amino syra ordnar. tRNAs ansågs länge som städning molekyler som saknade tillsynsuppdrag. En växande mängd bevis tyder dock på att cellulära tRNA nivåerna fluktuerar i korrespondens till varierande förhållanden såsom celltyp, miljö och stress. Fluktuationer i tRNA uttryck påverkar direkt gen översättning, gynnar eller förtränga uttrycket av specifika proteiner. Slutligen förstå dynamiken i proteinsyntesen kräver utveckling av metoder kunna leverera högkvalitativa tRNA profiler. Metoden som vi presenterar här heter SPOt, som står för strömlinjeformad plattform för observation tRNA. Platsen består av tre steg börjar med metabola märkning av cellkulturer med radioaktiva fosfat, följt av guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform utvinning av radioaktiva totala RNAs och slutligen hybridisering på egen tryckt macroarrays. tRNA nivåer beräknas genom att kvantifiera radioaktivitet Ljusstyrkorna vid varje sond plats. I protokollet presenteras här profil vi tRNAs i Mycobacterium smegmatis mc2155, en nonpathogenic bakterie som ofta används som modellorganism för att studera tuberkulos.
Cellulära tRNA nivåer används varierar enligt villkor såsom celltyp, miljö och stress1,2,3. SPOt, strömlinjeformad plattform för observation tRNA, är ett original, pålitlig, och okomplicerad teknik som tillåter snabb och exakt kvantifiering av överföring RNA-nivåer i laboratorium-fullvuxna organismer.
tRNAs har anmärkningsvärt stabil sekundära och tertiära strukturer4. De visar också talrika post-transcriptional ändringar5. Dessa funktioner utgör betydande strukturella och sekvens vägspärrar förspänns eller ibland förhindra direkt och reproducerbara tRNA profilering med standard riktmärke RNA kvantifiering tekniker6. Forskargrupper runt om i världen var tvungna att utveckla kreativa men ofta invecklade tekniker för att bedöma cellulära tRNA nivåer. Några av dessa metoder inkluderar: (1) tvådimensionella elektroforetisk separation av metaboliskt märkt tRNAs kombinerat med metodisk spot tilldelning av nordliga plumpen1; (2) individuell kvantifiering av Northern blot använder noggrant standardiserat radioaktiva DNA sonder7; (3) efter extraktion märkning med cyanin fluorokromer följt av microarray analys3, och (4) i vitro strippar av tRNA ändringar med hjälp av rekombinant demodification enzymer kombineras med omvänd Transkription och efterföljande hög genomströmning sekvensering8.
Platsen är en enkel och ursprungliga kombination av två standard och enkla metoder: (1) RNA kropp märkning, som består i syntesen, i växande organismer, av radioaktiva totala RNAs och (2) tRNA macroarrays, en systematisk och miniatyriserade genomisk verktyg optimerad för tRNA segregation.
Prover är strömlinjeformade från levande organismer till kvantifiering plattformen. De analyseras direkt efter extraktion och bearbetas inte längre som avsevärt inskränker fördomar jämfört med tekniker som kräver efter extraktion förstärkning eller enzymatiska behandlingar. Platsen är mångsidig och kan enkelt kombineras till polysome fraktionering att identifiera och kvantifiera tRNA subpopulations som är fysiskt associerade med att översätta ribosomer.
Det protokoll som presenteras här är optimerad för Mycobacterium smegmatis, och det användes också framgångsrikt till profil tRNAs Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, mus, och mänskliga cellodlingar11 .
Beta partikelutsläpp är kända bakteriehämmande och bakteriedödande medel14, men strålning i intervallet testade har ingen betydande inverkan på cell fitness. Scintillation räknar visade att radioaktiviteten är införlivad med 25% av totalt-cell extrakt och därefter 1% av renat totala RNAs.
Sonderna identiska storlekar, jämförbara smälttemperatur och GC innehåll, tillsammans med ett enhetligt protokoll för macroarray spotting, hybridisering och kvantifiering tillåter för opartisk mätning av tRNA nivåer direkt från plats signaler.
Plats är reproducerbara och specifika. Dess stort dynamiskt omfång och lätt justerbar tröskelvärdet tillåter profilering låg rikliga arter, såsom tRNAs förknippas med polysomes, helt enkelt genom att förlänga array exponering gånger9. Efter den inledande investeringen i nödvändig utrustning genomsnitt kör kostnad per prov, inklusive förbrukningsvaror, $15 per prover.
Platsen är tillämplig på någon organism vars arvsmassa är tillgänglig för sonden design. Modellorganismer som odlas i vitro är perfekta kandidater för metabola märkning. Som däggdjur genomen koda ofta många isodecoders (tRNAs som delar identiska Anticodonsen men Visa små skillnader i deras kropp sekvenser) måste sonderna vara delvis urartat till att bevara homogen hybridisering av nära tRNA arter. Slutligen, vidhäftande däggdjursceller avkastning vanligtvis lägre mängder av total-RNA jämfört med organismer odlas i suspension som M. smegmatis, så kulturer behöver vara väsentligen skalas upp.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd av SC INBRE bidrag från National Institute of General Medical Science – NIH (P20GM103499 att R.G.) och beviljar CA555536 & CA154664 från National Cancer Institute för P.H.H. Detta program var delvis genom ett bidrag till den College of Charleston från Howard Hughes Medical Institute igenom före college & Grundutbildning Science Education Program och stöds genom bidrag från nationellt centrum för forskningsresurser (P20 RR016461 5) och National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) från de National institutionerna of Health.
Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
[32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
7H9 broth | Difco | 271310 | |
Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
20 X SSC | Lonza | 51205 | |
SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |