تحليل موائع جزيئية خلية واحدة نجحت عصية
Summary
نحن نقدم طريقة لتحليل موائع جزيئية الأنساب الخلية البكتيرية الفردية باستخدام نجحت عصية على سبيل مثال. الأسلوب ويتغلب على أوجه قصور أساليب التحليلية التقليدية في علم الأحياء الدقيقة بالسماح بمراقبة مئات الأجيال الخلية تحت ظروف النمو يمكن السيطرة عليها بشكل محكم وموحدة.
Abstract
التكنولوجيا موائع جزيئية ويتغلب على العديد من القيود المفروضة على الطرق التحليلية التقليدية في علم الأحياء المجهرية. خلافا لأساليب الثقافة السائبة، ويوفر القرار خلية واحدة والمراقبة طويلة الأوقات التي تمتد مئات من الأجيال؛ بخلاف [اغروس] المستندة إلى منصة الفحص المجهري، أنها ظروف النمو موحد يمكن التحكم بشكل محكم. لأن يعزل التدفق المستمر لمتوسط نمو الخلايا في جهاز موائع جزيئية من اختلافات لا يمكن التنبؤ بها في البيئة الكيميائية المحلية الناجمة عن نمو الخلايا والايض، وتغييرات حقيقية في التعبير الجيني ونمو الخلايا في الاستجابة إلى ويمكن ملاحظة منبهات محددة أكثر ثقة. نجحت عصيات يستخدم هنا كأنواع بكتيرية نموذجية لإثبات “آلة أم”-اكتب أسلوب للتحليل الخلوي. علينا إظهار كيفية بناء ورأسيا جهاز موائع جزيئية وتحميله مع الخلايا وبدء التصوير المجهري وتعريض الخلايا لحافز عن طريق التحول من متوسط النمو واحد إلى آخر. مراسل تستجيب لإجهاد كمثال للكشف عن نوع البيانات التي يمكن الحصول عليها بهذه الطريقة. أيضا بإيجاز نناقش كذلك تطبيقات هذا الأسلوب لأنواع أخرى من التجارب، مثل تحليل تبوغ الجرثومي.
Introduction
واحدة من أبرز سمات الحياة على الأرض هو مرونة كبيرة ومتنوعة. هدفا مركزياً للبيولوجيا الجزيئية هو فهم المنطق الذي استخدم الخلايا الجينات والبروتينات لتحقيق أقصى قدر من النمو واللياقة البدنية تحت مجموعة متنوعة من الظروف البيئية. العلماء لتحقيق هذا الهدف، يجب أن تكون قادرة على مراقبة ثقة كيف تنمو خلايا فردية، تقسيم، والتعبير عن الجينات تحت مجموعة معينة من الظروف، مشيراً إلى كيفية استجابة الخلايا للتغييرات اللاحقة في البيئة الخاصة بهم. ومع ذلك، الأساليب التحليلية التقليدية في علم الأحياء المجهرية قد القيود التقنية التي تؤثر على أنواع الأسئلة التي يمكن معالجتها. على سبيل المثال، معظم التحليلات المستندة إلى الثقافة كانت مفيدة للغاية على مر السنوات، إلا أنها توفر بيانات مستوى السكان الذي يمكن أن تخفي الاختلافات خلية إلى خلية ذات مغزى أو في سلوك السكان الفرعية أصغر من الخلايا في مجموع السكان فقط. تحليلات خلية واحدة من البكتيريا الحية استناداً إلى الفحص المجهري الخفيفة تكشف عن سلوك خلية واحدة ولكن هي أيضا محدودة من الناحية الفنية. البكتيريا هي عادة معطلة على منصات [اغروس] يتضمن المتوسطة النمو، لكن الخليوي حشود شعبة ونمو رأي مجهرية ويستنزف المغذيات المتاحة بعد دورة الخلية عدد قليل، إلى حد كبير الحد من وقت الملاحظة1، 2. وعلاوة على ذلك، المحلية استنفاد المغذيات وتراكم ما يصاحب ذلك من تركات الأيضي نتيجة لنمو الخلايا تتغير باستمرار البيئة نمو الخلايا المحلية بطرق يصعب قياس أو التنبؤ بها. هذه التغييرات البيئية باستخدام منصات [اغروس] تشكل تحديا للدراسات من السلوكيات حالة ثابتة أو الاستجابات الخلوية لتغييرات معينة في ظروف النمو3.
التكنولوجيا موائع جزيئية، التي يتم تدفق وسيلة سائل بشكل مستمر من خلال أجهزة ميكروفابريكاتيد، ويقدم حلاً لقيود التجريبي الكلاسيكي. جهاز موائع جزيئية يمكن أن تبقى خلايا فردية في موقف للفحص المجهري خلية يعيش بينما تدفق متوسط النمو باستمرار توفر الخلايا مع المواد الغذائية الطازجة ويجرف تركات الأيضي والخلايا الزائدة، مما خلق نمو عالية موحدة البيئة. ظروف النمو المستمر، ويمكن ملاحظة السلوكيات الخلية بمعزل عن التأثير العوامل البيئية، والسماح بطريقة عرض دون عائق من المنطق الداخلي للخلايا. كما يمنع تدفق السائل أصبحت مزدحمة بخلايا الجهاز موائع جزيئية، المراقبة الأنساب خلية واحدة لعشرات أو مئات من الأجيال يصبح ممكناً4،5. مثل هذه الأوقات المراقبة طويلة تسمح بالكشف عن السلوكيات خلية طويل الأجل أو نادرة وإلا لا يمكن الكشف عنها. أخيرا، سيتم تكوين المتوسطة التي يمكن تغيير التدفقات من خلال الجهاز في السماح للخلايا التي سيحتفل بها كما أنها تستجيب لبداية الإجهاد أو مقدمة أو إزالة مجمع خاص.
وقد يتمتع ميكروفلويديكس بالفعل عدد من التطبيقات الهامة. على سبيل المثال، قد استخدمت في الأنسجة أو الجهاز، أو أجهزة الجسم على رقاقة، التي أنواع متعددة من الخلايا البشرية شارك مثقف لمحاكاة في فيفو شرط6؛ لدراسة حركة السلكية في بيئات ميكروستروكتوريد7؛ لدراسة التفاعلات بين الأغشية الحيوية البكتيرية (مثلاً، 8)؛ و للتغليف والتلاعب بكميات صغيرة من المواد الكيميائية (مثل، 9) أو الخلايا. أجهزة موائع جزيئية أصبحت شعبية متزايدة في مجال علم الأحياء الدقيقة (لملاحظات ممتازة، انظر 10 و 11)، لا سيما وأن سلامتهم البدنية وخصائص تدفق جيدا المتطابقة إلى منافذ الميكروبية الطبيعية12. على سبيل المثال، ميكروفلويديكس قد تم مؤخرا يستخدمها الأطباء لمثل هذه الأغراض كقياس دقة الخلية النمو وشعبة13،،من1415، تحليل حركة الممرض16، رصد الاستشعار عن النصاب القانوني17 و18من التحولات الفيزيولوجية، والعد للبروتين،19من بين العديد من الأمثلة الأخرى. الطريقة المعروضة هنا مصممة خصيصا لتحليل الأنساب الخلية البكتيرية الواحدة بدلاً من مجموعات من السلالات أو الأنواع. يستخدم الجهاز موائع جزيئية أثبت هنا تباين واحد “آلة الأم” تصميم4، التي تزرع الخلايا أحادية الملف داخل خندق موائع جزيئية مع نهاية مغلقة واحدة وواحدة من نهاية مفتوحة؛ نمو الخلايا وشعبة يدفع الخلايا ذرية من النهاية المفتوحة ويصل إلى تدفق السائل. تحليلاتنا عادة التركيز فقط على الخلية “الأم” التي تقتصر في نهاية مغلقة الخندق. أننا نعتبر هذا الأسلوب النهوض على السابقة الخفيفة على أساس الفحص المجهري خلية واحدة التقنيات التحليلية، مثل تجميد خلية على منصات [اغروس]. بينما نجحت (ب) يستخدم كنموذج هنا، الأسلوب الذي ينطبق أيضا على سائر الأنواع البكتيرية (الإشريكيّة القولونية نموذج مشترك آخر؛ وقد تتطلب بعض الأنواع ذات أحجام مختلفة من الخلية أو مورفولوجيس تصنيع الأجهزة الجديدة مع أبعاد مختلفة). يتطلب استخدام الصحفيين الفلورسنت لتمييز الخلايا وتصور التغييرات في التعبير الجيني استخدام الأنواع وراثيا أصعب؛ تحليلات لنمو الخلايا ومورفولوجيا غير ممكنة حتى بدون علامات مضيئة.
ويستبعد هذا البروتوكول عملية اختﻻق سيد السليكون التصويرية، التي كانت توصف على نطاق واسع في أماكن أخرى باستخدام5؛ يمكن أيضا أن تكون درجة الماجستير بسهولة الاستعانة بمصادر خارجية من مرافق ميكروفابريكيشن. ويشمل صب جهاز PDMS من سليكون المقوى ماجستير؛ ارتباط الجهاز بقطعة من الزجاج غطاء؛ تجميع موائع جزيئية مدخل ومخرج السباكة والصمامات قرصه بما في ذلك السماح بتبديل المتوسطة؛ تخميل الجهاز وإعداد الخلايا البكتيرية، وتحميل الجهاز مع الخلايا البكتيرية؛ إرفاق السباكة للجهاز واكويليبراتينج الخلايا؛ وتحميل الجهاز على مجهر الأسفار للتصوير. نظراً لأن العديد من الصور المختلفة اكتساب ومعالجة البرمجيات أدوات يمكن استخدامها لوضع تصور وتحليل البيانات المختلفة لمصلحة4،5، يتم عرض الصور مثلاً، ولكن لا يتم تضمين أساليب التقاط الصور في هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول ميكروفلويديكس يتسم بالمرونة في ذلك العديد من الخطوات التي يمكن تعديلها لتحسين استخدامها مع نوع معين أو سلالة أو لغرض محدد. وفي الواقع، في هذا البروتوكول قمنا بتعديلات على مفهوم “آلة الأم” الأصلي4 لتحسين استخدامها مع باء-نجحت. وغالباً ما تشكل الخنادق التي ت?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع من “المعاهد الوطنية للصحة” تحت GM018568. تم تنفيذ هذا البروتوكول في جزء في المركز لأنظمة النانو (CNS)، عضوا للوطنية تكنولوجيا النانو منسقة البنية التحتية الشبكة (ننسى)، الذي تدعمه “المؤسسة الوطنية للعلوم” NSF جائزة 1541959 رقم. الجهاز العصبي المركزي جزء من جامعة هارفارد. شكرا جزيلا تعود نورمان توماس والرب ناثان لعملهم في تصور واختلاق القالب الرئيسي المستخدم للأجهزة الموضحة هنا، وفي بناء على النسخة الأصلية للجهاز. كما نشكر يوهان بولسون لنصيحته التعاونية القيمة وأشكر أعضاء مختبرة للمشورة والتحسينات المستمرة للمستحضرات البكتيرية موائع جزيئية.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
