Encellede mikrofluid analyse af Bacillus subtilis
Summary
Vi præsenterer en metode til mikrofluid analyse af enkelte bakteriel celle lineages med Bacillus subtilis som eksempel. Metoden overvinder mangler af traditionelle analysemetoder i mikrobiologi ved at give observation af hundredvis af celle generationer under stramt styres og ensartet vækstbetingelser.
Abstract
Mikrofluid teknologi overvinder mange begrænsninger for de traditionelle analysemetoder i mikrobiologi. I modsætning til bulk-kultur metoder tilbyder det enkelt celle opløsning og lange observation gange spænder over hundredvis af generationer; i modsætning til Agarosen pad-baserede mikroskopi har det ensartede vækstbetingelser, der kan styres stramt. Fordi den konstant flow af vækstmediet isolerer cellerne i en mikrofluid enhed fra uforudsigelige variationer i den lokale kemiske miljø forårsaget af cellevækst og metabolisme, autentiske ændringer i genekspression og cellevækst i svar på bestemte stimuli kan observeres mere trygt. Bacillus subtilis bruges her som en model bakteriearter at påvise en “mor maskine”-Skriv metode for cellulære analyse. Vi viser, hvordan at konstruere og plumb en mikrofluid enhed, indlæse det med celler, indlede mikroskopisk billeddannelse og udsætte celler til et incitament ved at skifte fra én vækstmediet til en anden. En stress-responderende reporter bruges som et eksempel til at afsløre typen data, der kan opnås ved denne metode. Vi også kort diskutere yderligere anvendelser af denne metode til andre typer af forsøg, som analyse af bakteriel sporedannelse.
Introduction
En af de mest slående træk af livet på jorden er dens stor modstandsdygtighed og sort. Et centralt mål i Molekylærbiologi er at forstå den logik, som celler bruge gener og proteiner til at maksimere deres vækst og fitness under en bred vifte af miljøforhold. For at nå dette mål, skal forskerne kunne trygt iagttage hvordan individuelle celler vokse, kløft, og udtrykke deres gener under et givet sæt betingelser, at bemærke, hvordan celler reagerer på efterfølgende ændringer i deres miljø. Imidlertid har traditionelle analysemetoder i mikrobiologi tekniske begrænsninger, der påvirker typerne af spørgsmål, der kan behandles. For eksempel hovedparten kulturbaserede analyser har været meget nyttige i årenes, men de tilbyder kun befolkningen niveau data, som kan maskere meningsfuldt celle til celle variationer eller adfærd af mindre delpopulationer af celler i den samlede befolkning. Encellede analyser af levende bakterier baseret på lysmikroskopi afsløre encellede adfærd men også teknisk begrænset. Bakterier er typisk immobiliseret på Agarosen puder indeholdende vækstmediet, men celle vækst og division skarer visningen mikroskopiske og udtømmer de tilgængelige næringsstoffer efter blot et par celle cyklusser, betydeligt begrænser observation tid1, 2. Desuden, den lokale nedbrydning af næringsstoffer og den ledsagende ophobning af metaboliske biprodukter på grund af cellevækst konstant ændrer lokale celle vækst miljøet på måder, der er vanskelige at måle eller forudsige. Sådanne miljømæssige ændringer ved hjælp af Agarosen puder udgøre en udfordring for undersøgelser af steady-state adfærd eller cellulære svar til specifikke ændringer i vækst betingelser3.
Mikrofluid teknologi, hvor en flydende medium er konstant flød gennem microfabricated enheder, tilbyder en løsning til klassiske eksperimentelle begrænsninger. En mikrofluid enhed kan holde individuelle celler i holdning til live-celle mikroskopi, mens strømmen af vækstmediet konstant giver celler med friske næringsstoffer og vasker væk metaboliske biprodukter og overskydende celler, hvorved der skabes en meget ensartet vækst miljø. Under konstant vækstbetingelser, kan celle adfærd ses isoleret fra indflydelsen af miljøfaktorer, tillader en uhindret udsigt over den indre logik i celler. Som den flydende flow forhindrer mikrofluid enheden fra at blive overfyldt med celler, bliver observation af enkelt celle lineages for snesevis eller hundredvis af generationer muligt4,5. Sådanne lange observation gange muliggøre påvisning af ellers målbart langsigtede eller sjældne celle adfærd. Endelig vil sammensætningen af det medium, der løber gennem enheden kan ændres på, så celler skal overholdes som de reagerer på udbrud af en stress eller at indførelsen eller fjernelse af et bestemt stof.
Mikrofluidik har allerede haft en række vigtige applikationer. For eksempel, har det været brugt i væv, organ- eller krop-on-a-chip enheder, hvor flere menneskelige celletyper er co kulturperler at simulere en i vivo betingelse6; for studiet af nematodeprøveudtagning bevægelse i microstructured miljøer7; at undersøge interaktioner blandt bakterielle biofilm (fx, 8); og for indkapsling og manipulation af små mængder af celler eller kemikalier (f.eks., 9). Mikrofluid enheder er også blevet stadig mere populære inden for Mikrobiologi (for fremragende anmeldelser, se 10 og 11), især som deres fysiske og flowegenskaber er godt matchede til naturlige mikrobielle nicher12. For eksempel, har mikrofluidik været for nylig ansat mikrobiologer til sådanne formål som netop måle celle vækst og division13,14,15, analysere patogen bevægelse16, overvågning quorum sensing17 og fysiologiske overgange18, og protein tælle19, blandt mange andre eksempler. Metoden præsenteres her er specielt designet til analyse af enkelt bakteriel celle lineages snarere end kombinationer af stammer eller arter. Mikrofluid enheden demonstreret her udnytter en variation af “mor maskine” design4, hvor celler dyrkes enkelt-fil inden for en mikrofluid grøft med en lukket ende og en åben ende; cellevækst og division skubber afkom celler op og ud af den åbne ende i den flydende flow. Vores analyser typisk fokuserer udelukkende på den “mor” celle, der er begrænset på den lukkede ende af renden. Vi anser denne metode som en fremgang over tidligere lette mikroskopi-baserede encellede analytiske teknikker, såsom celle immobilisering på Agarosen puder. Mens B. subtilis bruges som model her, metoden gælder også for andre bakteriearter (Escherichia coli er en anden fælles model, nogle arter med forskellige cellestørrelser eller morfologier kan kræve fabrikation af nye enheder med forskellige dimensioner). Brug af fluorescerende journalister til at markere celler og at visualisere ændringer i genekspression kræver brug af genetisk tractable arter; analyser af cellevækst og morfologi er imidlertid muligt selv uden fluorescerende markører.
Denne protokol udelukker at opdigte silicium master ved hjælp af fotolitografi, som er blevet grundigt beskrevet andetsteds5; mastere kan også være let outsourcede fra microfabrication faciliteter. Det omfatter støbning af en PDMS enhed fra en forstærket silicium master; limning enhed til et stykke cover glas; montage mikrofluid fjorden og outlet VVS, ventiler herunder knivspids for at tillade medium skifte; passivating enheden og forberede bakterieceller læsning enhed med bakterieceller; vedhæftes enheden som VVS og equilibrating celler; og lastning enhed på et fluorescens mikroskop til billedbehandling. Fordi mange forskellige image erhvervelse og forarbejdning software værktøjer kan bruges til at visualisere og analysere forskellige data af renter4,5, er vist eksempler på billeder, men billedoptagelse metoder er ikke inkluderet i denne protokol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne mikrofluidik protokol er fleksibel, idet mange i foranstaltninger kan ændres for at optimere dets anvendelse med en bestemt art, stamme eller til et bestemt formål. Faktisk, i denne protokol har vi foretaget ændringer til den oprindelige “mor maskine” koncept4 til at optimere dets anvendelse med B. subtilis. Ofte, udgør skyttegrave, hvor cellerne er begrænset en enkeltlags funktion, der henviser til, at i denne protokol bruger vi to-lags celle skyttegrave, med en lavvandet kana…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af National Institutes of Health under GM018568. Denne protokol blev udført delvist på Center for nanoskala systemer (CNS), medlem af den nationale nanoteknologi koordineret infrastruktur netværk (NNCI), som støttes af National Science Foundation under NSF award no. 1541959. CNS er en del af Harvard University. Mange tak naturligvis Thomas Norman og Nathan Herren for deres arbejde med at blive gravid og opdigte master skabelonen bruges til enhederne, der vises her og i opbygningen af den oprindelige version af apparatet. Vi har også takke Johan Paulsson for hans værdifulde samarbejde rådgivning og takke medlemmerne af hans lab for deres rådgivning og fortsatte forbedringer af bakterielle mikrofluid apparater.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
