Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis
Summary
Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.
Abstract
Mikrofluidische Technologie überwindet viele der Einschränkungen zu den traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie. Anders als Massen-Kultur bietet es eine einzellige Auflösung und lange Beobachtung Zeiten überspannt Hunderte von Generationen; im Gegensatz zu Agarose Pad-basierte Mikroskopie hat es einheitliche Wachstumsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Weil der kontinuierliche Fluss von Nährmedium der Zellen in einem mikrofluidischen Gerät aus unvorhersehbaren Schwankungen in der chemischen Umgebung verursacht durch Zellwachstum und Stoffwechsel, authentische Veränderungen der Genexpression und das Zellwachstum in Reaktion auf isoliert bestimmte Reize können sicher beobachtet werden. Bacillus Subtilis dient hier als ein Modell Bakterienarten, eine “Mutter-Maschine” zu demonstrieren-Methode für die zelluläre Analyse geben. Wir zeigen, wie Sie zu konstruieren und mikrofluidischen Gerät zu ergründen, mit Zellen zu laden, mikroskopische Bildgebung zu initiieren, und setzen Zellen auf einen Reiz durch den Wechsel von einem Wachstumsmedium zum anderen. Stress-responsive Reporter wird als Beispiel verwendet, um den Typ der Daten offenbaren, die mit dieser Methode erzielt werden können. Wir diskutieren auch kurz weitere Anwendungen dieser Methode für andere Arten von Experimenten, wie z. B. Analyse der bakteriellen Sporenbildung.
Introduction
Eines der auffälligsten Merkmale des Lebens auf der Erde ist seine große Widerstandsfähigkeit und Vielfalt. Ein zentrales Ziel der Molekularbiologie ist es, die Logik zu verstehen, mit der Zellen Gene und Proteine verwenden, um ihr Wachstum und ihre Fitness unter verschiedensten Umweltbedingungen zu maximieren. Um dieses Ziel zu erreichen, Wissenschaftler dürfen getrost zu beobachten wie einzelne Zellen wachsen, teilen und express ihre Gene unter einem gegebenen Satz von Bedingungen, unter Hinweis darauf, wie Zellen auf nachträgliche Änderungen in ihrer Umgebung reagieren. Traditionellen analytische Methoden in der Mikrobiologie haben jedoch technische Einschränkungen, die die Arten von Fragen betreffen, die behandelt werden können. Zum Beispiel Bulk Kultur-basierte Analysen haben im Laufe der Jahre als sehr nützlich erwiesen, aber sie bieten nur Populationsebene Daten, die sinnvolle Zell-Zell-Varianten oder das Verhalten der kleinere Sub-Populationen von Zellen an der Gesamtbevölkerung überdecken können. Einzellige Analysen von lebenden Bakterien basierend auf Lichtmikroskopie einzellige Verhalten offenbaren aber auch technisch beschränkt. Bakterien sind in der Regel auf Agarose-Pads mit Wachstumsmedium, immobilisiert aber Zelle Wachstum und Teilung Massen die mikroskopische Ansicht und die verfügbaren Nährstoffe verbraucht, nach nur wenigen Zelle Zyklen deutlich begrenzen die Beobachtung Zeit1, 2. Darüber hinaus verändern die lokalen Erschöpfung der Nährstoffe und der gleichzeitige Aufbau von Stoffwechselprodukte durch Zellwachstum ständig die lokalen Zelle Wachstum Umwelt in einer Weise, die schwierig zu messen oder vorherzusagen. Solche Veränderungen der Umwelt mit Agarose-Pads stellen eine Herausforderung für Studien von stationären Verhaltensweisen oder der zellulären Reaktionen auf spezifische Veränderungen im Wachstum Bedingungen3.
Mikrofluidische Technologie, in denen ein flüssiges Medium Microfabricated Geräte ständig durchströmt wird bietet eine Lösung für klassische experimentelle Einschränkungen. Ein mikrofluidischen Gerät kann Einzelzellen für Leben-Zelle Mikroskopie in Position halten, während den Fluss der Wachstumsmedium ständig versorgt die Zellen mit frischen Nährstoffe und Stoffwechselprodukte und überschüssigen Zellen, wodurch eine sehr gleichmäßig wächst wäscht Umgebung. Unter konstanten Wachstumsbedingungen können losgelöst von der Einfluss von Umweltfaktoren, erlaubt einen ungehinderten Blick auf die innere Logik der Zellen Zelle Verhalten beobachtet werden. Da die Strömung mikrofluidischen Gerät verhindert, immer voll mit Zellen, wird Beobachtung der einzelnen Zelle Linien für Dutzende oder Hunderte von Generationen möglich4,5. So lange Beobachtungszeiten ermöglichen die Erkennung von sonst nicht nachweisbar langfristige oder seltenen Zelle Verhalten. Schließlich wird die Zusammensetzung des Mediums, die durch das Gerät fließt bei geändert werden können, Zellen zu beachten, da sie zu Beginn einer Belastung oder die Einführung oder die Entfernung einer bestimmten Substanz reagieren.
Mikrofluidik hat bereits eine Reihe von wichtigen Anwendungen genossen. Zum Beispiel wurde es verwendet in Gewebe, Organ oder Körper-on-a-Chip-Geräte, in denen mehrere menschliche Zelltypen Co kultiviert, eine in Vivo Zustand6zu simulieren sind. für die Studie der Nematoden Bewegung in mikrostrukturierten Umgebungen7; untersuchen Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Biofilmen (z.B. 8); und für die Kapselung und Manipulation von winzigen Mengen von Zellen oder Chemikalien (z.B. 9). Mikrofluidische Geräte auch auf dem Gebiet der Mikrobiologie (für sehr gute Kritiken, s. 10 und 11), zumal ihre körperliche zunehmend populär geworden und Fließeigenschaften sind gut aufeinander abgestimmt, um natürliche mikrobielle Nischen12. Zum Beispiel wurde Mikrofluidik vor kurzem von Mikrobiologen für solche Zwecke eingesetzt als Zelle Wachstum und Teilung13,14,15, Analyse der Erreger Bewegung16genau zu messen, Quorum sensing17 und physiologischen Übergänge18überwachen und für Protein zählen19, unter vielen anderen Beispielen. Die hier vorgestellte Methode ist speziell für die Analyse der einzelnen Bakterienzelle Linien anstatt Kombinationen von Sorten oder Arten. Das mikrofluidischen Gerät demonstriert hier nutzt eine Variante der “Mutter-Maschine” Design4, in dem Zellen Einzeldatei wachsen-innerhalb einer mikrofluidischen Graben mit einem geschlossenen und einem offenen Ende; Zelle Wachstum und Teilung schiebt Nachkommen Zellen oben und aus dem offenen Ende in die Strömung. Unsere Analysen konzentrieren sich in der Regel nur auf die “” Mutterzelle, die geschlossene Ende des Grabens beschränkt ist. Wir betrachten diese Methode als ein Fortschritt gegenüber früheren Licht Mikroskopie-basierte einzellige analytische Techniken, wie z. B. Zelle Immobilisierung auf Agarose-Pads. Während B. Subtilis als Vorbild dient, die Methode gilt auch für andere Bakterienarten (Escherichia coli ist ein weiteres gemeinsames Modell, einige Arten mit unterschiedlichen Zellgrößen oder Morphologien erfordern die Herstellung neuer Geräte mit verschiedenen Dimensionen). Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter um Zellen zu markieren und zu Veränderungen in der Genexpression zu visualisieren erfordert den Einsatz von genetisch gefügig Arten; Analysen von Zellwachstum und Morphologie sind jedoch auch ohne fluoreszierende Markierungen möglich.
Dieses Protokoll schließt den Prozess der Herstellung des Silizium-Meisters mittels Fotolithografie, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde5; Meister können auch leicht vom Microfabrication Einrichtungen ausgelagert werden. Freuen Sie sich auf die Ausformung eines PDMS-Geräts von einem verstärkten Silizium-Meister; kleben das Gerät an ein Deckglas; Montage der mikrofluidischen Einlass und Auslass Sanitär, Armaturen einschließlich Prise um mittlere umschalten zu ermöglichen; Passivierungslösung das Gerät, die Vorbereitung von Bakterienzellen und laden das Gerät mit Bakterienzellen; Befestigung der Rohrleitungen an das Gerät und Äquilibrierung der Zellen; und laden das Gerät auf eine Fluoreszenzmikroskop für die Bildgebung. Da viele verschiedene Bildaufnahme und processing-Software, die Werkzeuge verwendet werden können, zu visualisieren und analysieren Sie verschiedene Daten von Interesse4,5, sind Beispielbilder gezeigt, aber Bilderfassung Methoden sind in diesem Protokoll nicht enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Mikrofluidik-Protokoll ist flexibel, dass viele der Schritte zur Optimierung ihrer Nutzung mit einer bestimmten Art oder Sorte oder für einen bestimmten Zweck geändert werden können. In diesem Protokoll haben wir Änderungen an der ursprünglichen “Mutter-Maschine” Konzept4 zur Optimierung ihrer Nutzung mit B. Subtilisgemacht. Oft bilden die Schützengräben, in denen die Zellen beschränkt sind, eine einschichtige Funktion während in dieses Protokoll verwenden wir Zweischicht-Z…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde gefördert durch die National Institutes of Health unter GM018568. Dieses Protokoll wurde teilweise in der Mitte für Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied von der nationalen Nanotechnologie abgestimmte Infrastruktur Netzwerk (NNCI), durchgeführt, die von der National Science Foundation unter NSF Award Nr. 1541959 unterstützt wird. CNS ist Teil der Harvard University. Vielen Dank gebührt Thomas Norman und Nathan Herrn für ihre Arbeit bei der Konzeption und Herstellung der Mastervorlage für die Geräte gezeigt, hier und in den Aufbau der ursprünglichen Version des Geräts verwendet. Wir auch vielen Johan Paulsson für seine wertvolle gemeinsame Beratung und vielen Mitglieder von seinem Labor für ihre Ratschläge und weitere Verbesserungen zu bakteriellen mikrofluidischen Apparate.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
