ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis
Summary
אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.
Abstract
Microfluidic טכנולוגיה מתגבר על רבים מן המגבלות לשיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה. שלא כמו שיטות בצובר-תרבות, הוא מציע רזולוציית תא בודד והתבוננות ארוכה פעמים המתפרסות על-פני מאות דורות; בניגוד agarose המבוסס על דירת מיקרוסקופ, יש תנאי הגידול אחיד זה יכול להיות נשלט בחוזקה. כי זרימה רצופה של מדיום הגידול מבודד התאים במכשיר microfluidic של וריאציות לא צפוי בסביבה כימית מקומיות הנגרמת על ידי צמיחת תאים, חילוף החומרים, אותנטי שינויים בביטוי הגנים צמיחת תאים בתגובה גירויים מסוימים יכול להיות שנצפו בביטחון רב יותר. Bacillus subtilis משמש כאן כמו זן חיידקי דגם להפגין מכונה”אמא”-הקלד שיטה לניתוח הסלולר. אנו מראים כיצד לבנות לשרברב מכשיר microfluidic, לטעון אותו עם תאים, ליזום הדמיה מיקרוסקופיים ואני לחשוף תאים לגירוי על ידי מיתוג של מדיום הגידול אחד למשנהו. כתבת תגובה ללחץ משמש כדוגמה כדי לחשוף את סוג הנתונים שניתן להשיג על ידי שיטה זו. בקצרה גם נדון בהמשך יישומים של שיטה זו עבור סוגים אחרים של ניסויים, כגון ניתוח במחקרים על הנבגה חיידקי.
Introduction
אחד המאפיינים הבולטים ביותר של החיים על פני כדור הארץ הוא שלה חוסן נפשי גדול ומגוון. מטרה מרכזית של הביולוגיה המולקולרית היא להבין את ההיגיון שבו תאים להשתמש גנים, חלבונים כדי להגדיל את הצמיחה ואת כושר תחת מגוון רחב של תנאים סביבתיים. כדי להשיג מטרה זו, מדענים להיות מסוגל להתבונן בביטחון כמה תאים בודדים לגדול, לחלק ולבטא את הגנים שלהם תחת מערכת נתונה של תנאים, וציין כיצד התאים מגיבים לשינויים הבאים בסביבתם. עם זאת, מסורתיים שיטות אנליטיות במיקרוביולוגיה יש מגבלות טכניות המשפיעות על סוגי שאלות שיכול הליות ממוען. לדוגמה, בצובר מבוססת תרבות הניתוחים היה שימושי מאוד במשך השנים, אך הם מציעים רק הנתונים ברמת האוכלוסייה מטשטשים את משמעות וריאציות לתא או ההתנהגויות של אוכלוסיות משנה קטנים יותר של תאים במכלל האוכלוסייה. תא בודד ניתוחים של חיידקים החיים מבוסס על מיקרוסקופ אור לחשוף התנהגות תא בודד אבל גם מוגבלים מבחינה טכנית. חיידקים הם בדרך כלל ותשמרו על רפידות agarose שמכיל מדיום הגידול, אבל התא גדילה וחלוקה קהל התצוגה מיקרוסקופיים, מכלה את החומרים המזינים זמין לאחר כמה מחזורים תא, משמעותית להגביל את התצפית זמן1, 2. יתר על כן, דלדול המקומי של חומרים מזינים, הצטברות בו-זמני של תוצרי לוואי מטבוליים עקב צמיחת תאים משתנים ללא הרף הסביבה הצמיחה המקומית תא בדרכים שקשה למדוד או לנבא. שינויים סביבתיים כאלה באמצעות רפידות agarose להוות אתגר ללימודים של מצב יציב התנהגויות או הסלולר התגובות שינויים ספציפיים צמיחה תנאי3.
טכנולוגיית Microfluidic, שבו מדיום נוזלי מוזרם באופן רציף באמצעות התקנים microfabricated, מציעה פתרון מגבלות הניסוי הקלאסי. מכשיר microfluidic יכול לשמור תאים בודדים במצב מתאים לחיות תאים במיקרוסקופ בזמן הזרימה של מדיום הגידול באופן קבוע מספק תאים עם חומרים מזינים טריים, ייעלם תוצרי לוואי מטבוליים ותאים עודף, ובכך יוצר גידול מאוד אחידה סביבה. בתנאים צמיחה מתמדת, התנהגויות התא יכול להיות שנצפו במנותק מן ההשפעה של גורמים סביבתיים, המתיר נוף ללא הפרעה של ההיגיון הפנימי של תאים. זרימת נוזל מונע מההתקן microfluidic הופך צפוף עם תאים, התבוננות שושלות תא בודד עבור עשרות או מאות דורות הופך להיות אפשרי4,5. בזמנים כאלה התבוננות ארוכה היתר זיהוי התנהגויות אחרת לגילוי תאים לטווח ארוך או נדירים. לבסוף, ההרכב של המדיום זה הזורם דרך המכשיר יכול להשתנות בכל וויל, ומאפשר תאים שחלים באיזו תחילתה של הלחץ או מבוא או הסרה של תרכובת מסוימת.
מיקרופלואידיקה נהנתה כבר מספר יישומים חשובים. למשל, זה נעשה שימוש ברקמות, איברים או התקנים הגוף-על-שבב, שבה מספר סוגי תאים אנושיים הם תרבותי משותף כדי לדמות של ויוו תנאי6; לצורך המחקר של נמטודות בתנועת סביבות microstructured7; לבדוק אינטראקציות בין biofilms חיידקי (למשל, 8); כדי להפוך את עטיפת מניפולציה של כרכים קטנים של תאים או כימיקלים (למשל, 9). Microfluidic התקנים הפכו יותר ויותר פופולרי גם בתחום מיקרוביולוגיה (עבור ביקורות מצוינות, ראה 10 ו -11), במיוחד כמו הפיזי שלהם, תכונות הזרימה גם בהתאמה לנישות מיקרוביאלית טבעית12. למשל, מיקרופלואידיקה לאחרונה ננקטה על ידי מיקרוביולוגים למטרות כאלה כמו דיוק מדידה תא גדילה וחלוקה13,14,15, ניתוח תנועה הפתוגן16, ניטור quorum חישה17 ו מעברים פיזיולוגיים18, וספירת החלבונים19, בין דוגמאות רבות אחרות. השיטה המוצגת כאן היא תוכננה במיוחד עבור הניתוח של שושלות תא החיידק בודד יותר מאשר שילובים של זנים או מינים. המכשיר microfluidic המודגמות כאן מנצל וריאציה אחת של “אמא המכונה” עיצוב4, שבו תאים גדלים קובץ יחיד בתוך תעלה microfluidic עם קצה אחד סגור, קצה פתוח אחד; צמיחת תאים וחלוקה דוחף תאים רומא יוצא את הקצה הפתוח לתוך זרימת נוזלים. הבדיקות שלנו בדרך כלל מתמקדים רק התא “אמא” מוגבל בקצה הסגור של התעלה. אנו רואים בשיטה זו כמו קידום מעל הקודם אור מבוסס מיקרוסקופיה תא בודד בשיטות אנליטיות, כגון תא הנייח על רפידות agarose. בעוד B. subtilis משמש כמודל כאן, השיטה ישימה גם למינים אחרים חיידקי (Escherichia coli הוא מודל נפוץ נוסף; מינים מסוימים עם תאים שונים הגדלים או מורפולוגיות עשויים לדרוש הזיוף של מכשירים חדשים עם ממדים שונים). השימוש של כתבים פלורסנט כדי לסמן את התאים וכדי להמחיש שינויים בביטוי הגנים מחייב שימוש המינים גנטית צייתן; עם זאת, ניתוח של צמיחת תאים, מורפולוגיה אפשריים גם ללא סמנים פלורסנט.
בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל התהליך של בדיית המאסטר סיליקון באמצעות פוטוליתוגרפיה, אשר כבר מתואר בהרחבה במקום אחר5; ניתן בקלות מיקור חוץ של מתקני מיקרו-מלאכותית גם מאסטרים. היא כוללת המכייר של מכשיר PDMS מהמאסטר סיליקון מוקשח; מליטה להתקן חתיכת זכוכית מכסה; הרכבת microfluidic כניסת ואינסטלציה outlet, קמצוץ כולל שסתומים להתיר מיתוג בינונית; passivating המכשיר, הכנת תאים חיידקיים, טעינת המכשיר עם תאים חיידקיים; חיבור הצנרת להתקן, equilibrating התאים; טעינת המכשיר על גבי מיקרוסקופ פלורסצנטיות עבור הדמיה. כי ייבוא תמונות שונות רבות ועיבוד תוכנה ניתן להשתמש בכלים כדי להמחיש ולנתח נתונים שונים של עניין4,5, תמונות לדוגמה מוצגים, אך שיטות לכידת התמונה לא נכללות פרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מיקרופלואידיקה הוא גמיש כי רבים מן השלבים ניתן לשנות כדי למטב את השימוש עם מינים מסוימים או זן או למטרה מסוימת. ואכן, ב פרוטוקול זה עשינו שינויים המקורי “האם מכונה” קונספט4 כדי למטב את השימוש עם B. subtilis. לעתים קרובות, התעלות שבו מרותקים התאים מהווה תכונה שכבה אחת,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת GM018568. פרוטוקול זה בוצעה באופן חלקי במרכז עבור ננו מערכות (CNS), חבר של נבחרת ננוטכנולוגיה מתואמת תשתית רשת (NNCI), אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת ה-NSF פרס 1541959 מס. CNS מהווה חלק מאוניברסיטת הרווארד. תודה רבה הן בשל תומאס נורמן ואדון נתן לעבודתם להריון, בדיית בתבנית האב המשמש עבור ההתקנים המוצגים כאן, בבניין את הגירסה המקורית של המנגנון. אנחנו גם תודה פאולסון יוהן על עצתו שיתופי יקר ותודה חברי המעבדה שלו עצה, שיפורים המשך מנגנוני microfluidic חיידקי.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
