Encellede Microfluidic analyse av Bacillus subtilis
Summary
Vi presenterer en metode for microfluidic analyse av bakteriell enkeltcelle overleveringslinjer eksempel på bruk av Bacillus subtilis . Metoden overvinner svakhetene i tradisjonelle analytiske metoder i mikrobiologi ved observasjon av hundrevis av cellen generasjoner vilkår tett kontrollerbar og ensartet vekst.
Abstract
Microfluidic teknologi overvinner mange av begrensningene til tradisjonelle analytiske metoder i mikrobiologi. I motsetning til bulk-kultur metoder tilbyr encellede oppløsning og lang observasjon ganger som består av hundrevis av generasjoner; i motsetning agarose pad-baserte mikroskopi har det jevn vekst forhold som kan være strengt kontrollert. Fordi kontinuerlig flyten av vekstmediet isolerer cellene i en microfluidic enhet fra uforutsigbare variasjoner i det lokale kjemiske miljøet forårsaket av cellevekst og metabolisme, autentisk endringer i genuttrykk og cellevekst svar bestemt stimuli kan observeres mer trygt. Bacillus subtilis brukes her som en modell bakterie-art å demonstrere en “mor machine”-type metode for mobilnettet analyse. Vi viser hvordan å konstruere og lodde en microfluidic enhet, laste den med celler, starte mikroskopiske bildebehandling og utsette en stimulans celler ved å bytte fra én oppblomstringen medium til et annet. Stress-responsive reporter brukes som et eksempel for å avsløre hvilken datatype som kan oppnås av denne metoden. Vi også kort diskutere videre søknader av denne metoden for andre typer eksperimenter, som analyse av bakteriell sporulation.
Introduction
En av de mest slående funksjonene for livet på jorden er den store elastisitet og utvalg. Molekylærbiologi sentrale mål er å forstå logikken som cellene bruke gener og proteiner for å maksimere deres vekst og fitness under en rekke forhold. For å oppnå dette målet, forskere må kunne trygt observere hvordan enkelte cellene vokse, dele og uttrykke sine gener under et gitt sett med vilkår, merke hvordan cellene reagerer senere endringer i miljøet. Men har tradisjonelle analytiske metoder i mikrobiologi tekniske begrensninger som påvirker spørsmålstyper som kan løses. For eksempel bulk kultur-baserte analyser har vært svært nyttig gjennom årene, men de tilbyr bare befolkningsnivå data som kan maskere meningsfull celle til celle variasjoner eller atferd av mindre Sub-populasjoner av celler i befolkningen. Encellede analyser av levende bakterier basert på * lys avsløre encellede atferd, men er også teknisk begrenset. Bakterier er vanligvis immobilisert på agarose pads som inneholder vekst medium, men celle vekst og divisjon folkemengder mikroskopiske visningen og reduserer tilgjengelig næringsstoffer etter kun cellen sykluser, vesentlig begrenser observasjon time1, 2. Videre forandrer lokale uttømming av næringsstoffer og samtidig opphoping av metabolske biprodukter på grunn av cellevekst lokale celle vekst miljøet på måter som er vanskelige å måle eller forutsi. Slike miljøendringer benytter agarose pads utgjør en utfordring til studier av stabil eller cellular svar på spesifikke endringer i vekst forhold3.
Microfluidic-teknologi, som et flytende medium er kontinuerlig sirkulerer gjennom microfabricated enheter, tilbyr en løsning til klassiske eksperimentelle begrensninger. En microfluidic enhet kan holde enkeltceller i posisjon for live-celle mikroskopi mens flyten av vekstmediet stadig gir cellene frisk næringsstoffer og vasker bort metabolske biprodukter og overflødig celler, og dermed skape en svært ensartet vekst miljø. Under konstant vekst forhold, kan celle atferd observeres i isolasjon fra påvirkning av miljømessige faktorer, tillater en uhindret utsikt over den indre logikken i celler. Som strømning hindrer microfluidic enheten i å bli overfylt med celler, blir observasjon av enkeltcelle overleveringslinjer for titalls eller hundrevis av generasjoner mulig4,5. Så lang tid tillater påvisning av ellers undetectable langsiktige eller sjeldne celle atferd. Til slutt, sammensetningen av mediet som renner gjennom enheten kan endres på vilje, slik at cellene å bli observert som de reagerer starten på en stress eller til introduksjon eller fjerning av et bestemt sammensatt.
MicroFluidics har allerede hatt en rekke viktige programmer. For eksempel er det brukt i vev, orgel- eller kroppen på-chip enheter, der flere menneskelige celletyper er co kultivert å simulere en i vivo tilstand6; for studier av Rundormer bevegelse i microstructured miljøer7; undersøke interaksjon mellom bakteriell biofilm (f.eks, 8); og for innkapsling og manipulering av små mengder celler eller kjemikalier (f.eks, 9). Microfluidic enheter har også blitt stadig mer populært i feltet for mikrobiologi (for gode anmeldelser, se 10 og 11), særlig ettersom deres fysiske flytegenskaper er godt matchet naturlig mikrobiell nisjer12. For eksempel har microfluidics vært nylig ansatt av microbiologists slike formål som nøyaktig måling av celle vekst og divisjon13,14,15, analysere patogen movement16, overvåking quorum sansing17 og fysiologiske overganger18og for protein telle19, blant mange andre eksempler. Metoden som presenteres her er spesielt utformet for analyse av bakteriell enkeltcelle linjene i stedet for kombinasjoner av stammer eller arter. Microfluidic enheten demonstrert her benytter en variasjon av “mor machine” design4, der celler er vokst enkeltfiler i en microfluidic grøft med en lukket ende og én åpen ende; cellevekst og divisjon presser avkom celler opp og ut av den åpne enden i væske flyten. Våre analyser vanligvis fokusere bare på “mor” cellen som er begrenset i lukket slutten av grøften. Vi anser denne metoden som en fremgang over forrige lys mikroskopi-baserte encellede analytiske teknikker, for eksempel celle immobilisering på agarose pads. Mens B. subtilis brukes som modell her, metoden gjelder også for andre bakterie-art (Escherichia coli er en annen vanlig modell, noen arter med ulike celle størrelser eller morphologies kan kreve fabrikasjon av nye enheter med ulike dimensjoner). Bruk av fluorescerende journalister å merke celler og visualisere endringer i genuttrykk krever bruk av genetisk medgjørlig arter; analyser av cellevekst og morfologi er imidlertid mulig selv uten fluorescerende markører.
Nåværende protokollen utelukker prosessen med fabrikasjon silisium master med klima og jordsmonn, som har blitt grundig beskrevet andre steder5; maler kan også være enkelt outsourcet fra microfabrication fasiliteter. Det inkluderer forming av en PDMS enhet fra en forsterket silisium master; liming enheten til et stykke dekke glass; montering microfluidic innløp og utløp avløp, ventiler inkludert knipe for å tillate middels bytte; passivating enheten forbereder bakterielle celler og lasting enheten med bakterielle celler. feste avløp til enheten og equilibrating celler. og lasting enheten til fluorescens mikroskop for bildebehandling. Fordi mange forskjellige bildeopptak og prosessering programvare verktøy kan brukes til å visualisere og analysere ulike data rundt4,5, eksempel bilder vises, men ta avbildninger metoder er ikke inkludert i denne protokollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne microfluidics protokollen er fleksibel i at mange av disse trinnene kan endres for å optimalisere bruken med bestemt arter eller stamme eller for et bestemt formål. Faktisk i denne protokollen har vi gjort endringer i den opprinnelige “mor machine” konsept4 å optimalisere bruken med B. subtilis. Ofte utgjør skyttergravene som cellene er begrenset en enkeltlags-funksjonen, mens i denne protokollen bruker vi to-lags celle skyttergravene, med en grunne kanal rundt cellene. To-lags …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health under GM018568. Denne protokollen ble utført delvis ved Center for nanoskala systemer (CNS), medlem av det nasjonale nanoteknologi koordinert infrastruktur nettverk (NNCI), som støttes av National Science Foundation under NSF prisen nr. 1541959. CNS er del av Harvard University. Mange takk er Thomas Norman og Nathan Lord for sitt arbeid med graviditet og fabrikasjon master malen som brukes for enhetene som vises her, og bygge den opprinnelige versjonen av apparatet. Vi takker Johan Paulsson for sine verdifulle samarbeidende råd og takke medlemmer av hans lab for råd og kontinuerlige forbedringer til bakteriell microfluidic apparatene.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
