Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis
Summary
Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.
Abstract
Microfluidic tecnologia supera muitas das limitações que os métodos analíticos tradicionais em microbiologia. Ao contrário de métodos de cultura de massa, oferece resolução de célula única e longa observação vezes abrangendo centenas de gerações; ao contrário de agarose baseada em almofada microscopia, tem condições de crescimento uniforme que podem ser rigidamente controladas. Porque o fluxo contínuo de meio de cultura isola as células em um dispositivo microfluidic de variações imprevisíveis no ambiente químico local causada pelo crescimento celular e metabolismo, autênticas alterações na expressão gênica e crescimento celular em resposta a estímulos específicos podem ser observados com mais confiança. Bacillus subtilis é usado aqui como uma espécie de bactéria modelo para demonstrar uma máquina de”mãe”-digite o método para análise de celular. Mostramos como construir e interpretar um dispositivo microfluidic, carregá-lo com células, iniciar a geração de imagens microscópica e expor as células a um estímulo, passando de um meio para outro. Um repórter de stress-responsivo é usado como um exemplo para revelar o tipo de dados que podem ser obtidos por esse método. Nós também brevemente discutir aplicações desse método para outros tipos de experimentos, tais como análise de esporulação bacteriana.
Introduction
Uma das características mais marcantes da vida na terra é sua grande resiliência e variedade. Um objetivo central da biologia molecular é entender a lógica pela qual células usam genes e proteínas para maximizar seu crescimento e aptidão sob uma ampla variedade de condições ambientais. Para atingir este objetivo, os cientistas devem ser capazes de observar com confiança como células individuais crescem, dividem e expressam seus genes sob um determinado conjunto de condições, observando como as células respondem às alterações subsequentes no seu ambiente. No entanto, os métodos analíticos tradicionais em microbiologia têm limitações técnicas que afetam os tipos de perguntas que podem ser abordados. Por exemplo, em massa baseada em cultura análises foram muito úteis ao longo dos anos, ainda oferecem somente os dados de nível populacional que podem mascarar variações significativas de célula para célula ou os comportamentos de menores sub-populações de células na população total. Análises de célula única de bactérias de vida baseadas em microscopia de luz revelam o comportamento de célula única, mas também são tecnicamente limitadas. Bactérias normalmente são imobilizadas em almofadas de agarose contendo meio de crescimento, mas multidões de crescimento e divisão de pilha a visão microscópica e esgota os nutrientes disponíveis após poucos ciclos de célula, limitando substancialmente o tempo de observação1, 2. Além disso, a local depleção de nutrientes e o concomitante acúmulo de subprodutos metabólicos devido ao crescimento celular estão mudando constantemente o ambiente de crescimento celular local de maneiras que são difíceis de medir ou prever. Tais mudanças ambientais usando almofadas de agarose representam um desafio para estudos de comportamentos de estado estacionário ou de respostas celulares para alterações específicas nas condições de crescimento3.
Microfluidic tecnologia, no qual um meio líquido é continuamente fluiu através de dispositivos microfabricated, oferece uma solução para limitações experimentais clássicas. Um dispositivo microfluidic pode manter células individuais em posição para microscopia de viver-pilha quando o fluxo do meio de crescimento constantemente fornece as células com nutrientes frescos e lava subprodutos metabólicos e células em excesso, criando assim um crescimento altamente uniforme meio ambiente. Sob condições de constante crescimento, observam-se comportamentos de célula isolada da influência de fatores ambientais, permitindo uma vista desimpedida da lógica interna das células. Como o fluxo de fluido impede que o dispositivo microfluidic tornando-se repleto de células, observação de linhagens de célula única para dezenas ou centenas de gerações torna-se possível4,5. Estes tempos de longa observação permitam a detecção de comportamentos de célula a longo prazo ou raro caso contrário indetectável. Finalmente, a composição do meio que flui através do dispositivo pode ser alterados no Irão, permitindo que as células a serem observados como eles respondem ao aparecimento de um estresse ou para a introdução ou remoção de um determinado composto.
Microfluídica já tem desfrutado de um número de aplicações importantes. Por exemplo, ela tem sido usada em tecido, órgão ou dispositivos de corpo-em-um-microplaqueta, em que vários tipos de células humanas são co cultivados para simular na vivo condição6; para o estudo do movimento de nematoides em ambientes microstructured7; para examinar as interações entre biofilmes bacterianos (e.g., 8); e para o encapsulamento e a manipulação de pequenos volumes de células ou de produtos químicos (por exemplo, 9). Dispositivos microfluídicos também tornaram-se cada vez mais populares no campo da microbiologia (para excelentes críticas, ver 10 e 11), especialmente como seu físico e propriedades de fluxo são bem-acompanhado para nichos microbianos naturais12. Por exemplo, microfluídica foi recentemente empregada por microbiologistas para tais fins como medir precisamente celular crescimento e divisão13,14,15, analisando o patógeno movimento16, monitoramento de sensoriamento de quórum17 e transições fisiológica18e para proteína contando com19, entre muitos outros exemplos. O método apresentado aqui é projetado especificamente para a análise de linhagens única célula bacteriana, ao invés de combinações de cepas ou espécies. O dispositivo microfluidic demonstrado aqui utiliza uma variação do “máquina de mãe” projeto4, em que as células são cultivadas arquivo único dentro de uma trincheira microfluidic com uma extremidade fechada e uma aberta; divisão e crescimento celular empurra as células descendentes cima e para fora a extremidade aberta para o fluxo de fluido. Nossas análises geralmente se concentram apenas na célula “mãe” que está confinada na extremidade fechada da trincheira. Consideramos este método como um avanço sobre anteriores leves baseado em microscopia célula única técnicas analíticas, tais como imobilização de células em almofadas de agarose. Enquanto b. subtilis é usado como um modelo aqui, o método também é aplicável a outras espécies de bactérias (Escherichia coli é um outro modelo comum; algumas espécies com tamanhos diferentes de célula ou morfologias podem exigir a fabricação de novos dispositivos com dimensões diferentes). O uso de repórteres fluorescentes para marcar células e visualizar as alterações na expressão gênica requer o uso de espécies geneticamente tractable; no entanto, análises de crescimento celular e morfologia são possíveis mesmo sem marcadores fluorescentes.
O presente protocolo exclui o processo de fabricar o mestre de silício usando photolithography, que tem sido amplamente descrito em outra parte5; mestres também podem ser facilmente terceirizados de microfabrication instalações. Ele inclui o molde de um dispositivo PDMS de um mestre de silicone reforçado; ligação do dispositivo com um pedaço de vidro de tampa; montando o microfluidic entrada e saída encanamento, incluindo pitada válvulas para permitir a comutação médio; passivação do dispositivo, preparando as células bacterianas e carregar o aparelho com as células bacterianas; anexar o encanamento para o dispositivo e desenroscada as células; e carregar o dispositivo em um microscópio de fluorescência para a imagem latente. Porque muitos imagem diferente de aquisição e processamento de software ferramentas podem ser usadas para visualizar e analisar dados diferentes de interesse4,5, imagens de exemplo são mostradas, mas os métodos de captura de imagem não estão incluídos neste protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de microfluídica é flexível, em que muitos dos passos podem ser modificados para otimizar o seu uso com uma determinada espécie ou cepa ou para uma finalidade específica. Com efeito, neste protocolo, fizemos modificações para o original de “máquina de mãe” conceito4 para otimizar seu uso com b. subtilis. Muitas vezes, as trincheiras em que as células estão confinadas constituem um recurso de camada única, Considerando que neste protocolo usamos trincheiras da do…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi financiado pelo National Institutes of Health, sob GM018568. Este protocolo foi realizado em parte no centro para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prêmio NSF n º 1541959. CNS é parte da Universidade de Harvard. Muitos agradecimentos são devidos a Thomas Norman e Nathan Senhor por seu trabalho em conceber e fabricar o modelo mestre, usado para os dispositivos mostrados aqui e na construção da versão original do aparelho. Também agradecemos a Johan Paulsson por sua valiosa colaboração assessoria e agradecer aos membros de seu laboratório para seus conselhos e melhorias contínuas para aparelhos microfluidic bacteriana.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
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