Анализ одной ячейки Microfluidic Сенная палочка
Summary
Мы представляем метод для анализа microfluidic индивидуальных бактериальных клеток линий с помощью Сенная палочка в качестве примера. Этот метод преодолевает недостатки традиционных аналитических методов в микробиологии, позволяя наблюдения сотни поколений клеток в условиях роста плотно контролируемым и единообразной.
Abstract
Microfluidic технология преодолевает многие ограничения традиционных аналитических методов в микробиологии. В отличие от методов массовой культуры он предлагает резолюции одноклеточных и длительного наблюдения раз охватывающих сотни поколений; в отличие от агарозы микроскопии основанные на площадку он имеет условия форма роста, которые могут быть жестко контролируется. Потому что непрерывный поток роста средних изолирует клетки в microfluidic устройство от непредсказуемых колебаний в местной химической среде, вызванных рост клеток и метаболизм, подлинные изменения в экспрессии генов и рост клеток в ответ на конкретные стимулы могут наблюдаться более уверенно. Сенная палочка используется здесь как модель бактериального вида продемонстрировать машину «мать»-метод для клеточного анализа типа. Мы покажем, как построить и отвес microfluidic устройства, загрузить его с клетками, инициировать микроскопических изображений и разоблачить клетки на раздражитель путем переключения от одного роста среднего в другой. Стресс отзывчивым репортер используется в качестве примера для выявления типа данных, которые могут быть получены этим методом. Мы также кратко обсудить применение этого метода для другие виды экспериментов, например анализ Бактериальное заспорение.
Introduction
Одна из самых ярких особенностей жизни на земле является его большой устойчивостью и разнообразие. Центральная цель молекулярной биологии — понять логику, в которой клетки используют генов и белков для максимизации их роста и фитнес под широкий спектр условий окружающей среды. Для достижения этой цели, ученые должны уметь уверенно наблюдать как отдельные клетки растут, разделить и выразить свои гены под заданный набор условий, отметив, как клетки отвечают на последующие изменения в их среде. Однако традиционные аналитических методов в микробиологии имеют технические ограничения, которые влияют на типы вопросов, которые могут быть решены. К примеру массовых анализов на основе культуры были весьма полезны с годами, но они предлагают только уровень населения данные, которые могут маскировать значимых в ячейке вариации или поведения меньше суб популяции клеток в общей численности населения. Одноклеточных анализ живых бактерий, основанные на световой микроскопии раскрыть поведение одной ячейки, но также технически ограничены. Бактерии обычно иммобилизованных на агарозы колодки, содержащие среднего роста, но мобильный рост и деление толпы микроскопические видом и истощает имеющиеся питательных веществ после нескольких циклов клеток, существенно ограничивая время наблюдения1, 2. Кроме того местные истощение питательных веществ и сопутствующей накопление метаболических побочных продуктов из-за роста клеток, постоянно меняется окружающей среды рост местной ячейки способами, которые трудно измерить или предсказать. Такие экологические изменения, используя агарозы колодки представляют собой вызов для исследования поведения стационарном или клеточных реакций на конкретные изменения в условиях роста3.
Microfluidic технология, в которой жидкой среде постоянно текла через microfabricated устройства, предлагает решение для классических экспериментальных ограничений. Microfluidic устройство может держать отдельные ячейки в положении для микроскопии клеток, в то время как поток среднего роста постоянно обеспечивает клетки с свежих питательных веществ и смывает метаболических побочных продуктов и избыток клетки, создавая тем самым весьма форма роста окружающей среды. В условиях постоянного роста поведение клеток может наблюдаться в отрыве от влияния экологических факторов, позволяющих беспрепятственный вид внутренней логики клеток. Как потока жидкости microfluidic устройство предотвращает становится переполненном с клетками, наблюдение за одну ячейку линий для десятки или сотни поколений становится возможным4,5. Такие длинные наблюдения раз разрешить обнаружение иначе обнаружить долгосрочный или редкие клеток поведения. И наконец состав среды, которая протекает через устройства могут быть изменены на будет, позволяя клетки, чтобы наблюдать, как они реагируют к возникновению стресса или введения или удаления конкретного соединения.
Микрофлюидика уже пользуется ряд важных приложений. Например он был использован в ткани, орган или орган на чипе устройств, в которых различные типы клеток человека совместно культивируемых для имитации в естественных условиях состояние6; для изучения движения нематод в microstructured средах7; для изучения взаимодействия между бактериальных биопленок (например, 8); и для инкапсуляции и манипуляции крошечные количества клеток или химических веществ (например, 9). Microfluidic приборы также становятся все более популярными в области микробиологии (для отличные отзывы, см. 10 и 11), особенно в их физической и реологические свойства хорошо соответствует12природных микробных ниш. К примеру микрофлюидика недавно работал, микробиологов для таких целей, как точно измеряя клеток рост и деление13,14,15, анализируя возбудителя движения16, мониторинг кворума зондирования17 и18физиологических переходы и для белка подсчета19, среди многих других примеров. Представленные здесь метод разработан специально для анализа линий одного бактериальной клетки, вместо того, чтобы комбинации штаммов или видов. Microfluidic устройство, продемонстрировали здесь использует один из вариантов «мать машина» Дизайн4, в котором клетки выращивают одного файла в окопе microfluidic с одним закрытым концом и один открытый конец; деление и рост клеток толкает потомства клетки и из открытого конца в поток жидкости. Наш анализ обычно сосредоточиться только на ячейку «мать», которая ограничивается на закрытом конце траншеи. Мы рассматриваем этот метод как выдвижение более предыдущих света на основе микроскопии одноклеточных аналитических методов, таких как иммобилизация клеток на агарозы колодки. Хотя B. subtilis используется в качестве модели здесь, метод применим также для других видов бактериальных (кишечная палочка -это еще одна распространенная модель; некоторые виды размеров различных ячеек или морфологии потребуется изготовление новых устройств с различными размерами). Использование флуоресцентных репортеров в ознаменование клетки и визуализировать изменения в экспрессии генов требует использования генетически шансов справиться с возникающими видов; Однако анализ роста клеток и морфология возможны даже без флуоресцентных маркеров.
Настоящий Протокол исключает процесс изготовления кремниевых мастер, с помощью фотолитографии, которая была подробно описана в других5; мастера также может быть легко аутсорсинг от микротехнологий зал. Она включает в себя формования PDMS устройства из армированного кремния мастер; Склеивание устройства на кусок стекла; Сборка microfluidic входе и выходе сантехники, включая щепотку клапанов разрешить средний коммутации; пассивация устройства, подготовке бактериальной клетки и загрузки устройства с бактериальной клетки; установка сантехники на устройство и equilibrating клетки; и загрузка устройства на микроскопом флуоресценции для воображения. Потому что многие приобретения различных изображений и обработки программного обеспечения, инструменты можно использовать для визуализации и анализа данных интерес4,5, пример изображения отображаются, но методы захвата изображения не включаются в этот протокол.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол микрофлюидика является гибким, что многие из шагов могут быть изменены для оптимизации ее использования с отдельных видов или деформации или для конкретной цели. Действительно в этом протоколе мы внесли изменения в оригинальной концепции «мать машина»4 для ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался национальных институтов здравоохранения под GM018568. Этот протокол был проведен в части в центре для наноразмерных систем (ЦНС), членом из национального нанотехнологии скоординированной инфраструктуры сети (NNCI), который поддерживается Национальный научный фонд под NSF премии № 1541959. CNS является частью Гарвардского университета. Большое спасибо из-за Норман Томас и лорд Натан за их работу в зачатие и изготовления мастер шаблон, используемый для устройства, показанные здесь и в здании оригинальной версии аппарата. Мы также поблагодарить Johan Паулссон за его ценные совместные консультации и поблагодарить членов его лаборатории за их советы и дальнейшее совершенствование бактериальных microfluidic приборы.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
