Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis
Summary
Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.
Abstract
Tecnología de microfluidos supera muchas de las limitaciones a los métodos analíticos tradicionales en Microbiología. A diferencia de los métodos de cultivo a granel, ofrece resolución de unicelular y observación larga épocas que abarca cientos de generaciones; a diferencia de agarosa microscopia basada en pad, tiene condiciones de crecimiento uniforme que pueden ser bien controladas. Porque el continuo flujo de medio de cultivo aísla las células en un dispositivo de microfluidos de variaciones impredecibles en el ambiente químico local causado por el crecimiento celular y metabolismo, auténticos cambios en la expresión génica y crecimiento celular en respuesta a estímulos específicos pueden observarse con más confianza. Bacillus subtilis se utiliza aquí como una especie bacteriana de modelo para demostrar una “máquina de la madre”-tipo de método para el análisis celular. Mostramos cómo construir vertical un dispositivo de microfluidos, cargar con las células, iniciar la proyección de imagen microscópica y exponer las células a un estímulo por la conmutación de un medio a otro. Un reportero sensible al estrés se utiliza como ejemplo para revelar el tipo de datos que pueden obtenerse por este método. También discutimos brevemente más aplicaciones de este método para otros tipos de experimentos, tales como análisis de esporulación bacteriana.
Introduction
Una de las características más llamativas de la vida en la tierra es su gran resistencia y variedad. Una meta central de la biología molecular es comprender la lógica por la que las células utilizan genes y proteínas para maximizar su crecimiento y aptitud bajo una amplia variedad de condiciones ambientales. Para lograr este objetivo, los científicos deben ser capaces de observar con confianza cómo las células individuales crecen, dividirán y expresan sus genes en un conjunto dado de condiciones, observando cómo las células responden a los cambios posteriores en su entorno. Sin embargo, los métodos analíticos tradicionales en Microbiología tienen limitaciones técnicas que afectan los tipos de preguntas que pueden abordarse. Por ejemplo, a granel los análisis basados en la cultura han sido muy útiles en los años, sin embargo, ofrecen sólo datos a nivel de población que pueden enmascarar variaciones significativas de célula a célula o los comportamientos de las subpoblaciones más pequeñas de las células en una población total. Análisis unicelular de bacteria viva basada en microscopía de luz revelan comportamiento unicelular pero también técnicamente limitados. Las bacterias generalmente son inmovilizadas sobre soportes de agarosa que contienen medio de cultivo, pero multitudes de crecimiento y la división de la célula Vista microscópica y agotan los nutrientes disponibles después de pocos ciclos de célula, limitando sustancialmente el tiempo de observación1, 2. Por otra parte, la depleción local de nutrientes y la acumulación concomitante de subproductos metabólicos debido al crecimiento de la célula cambian constantemente el ambiente de crecimiento de célula local en formas que son difíciles de medir o predecir. Tales cambios ambientales usando teclas de agarosa representan un desafío a los estudios de comportamiento de estado estacionario o de respuestas celulares a cambios específicos en las condiciones de crecimiento3.
Tecnología de microfluidos, en el que un medio líquido continuamente es atravesado recientemente dispositivos, ofrece una solución a las limitaciones experimentales clásicos. Un dispositivo microfluídico puede mantener células individuales en posición para microscopía de células vivas, mientras que el flujo del medio de cultivo constante proporciona células con nutrientes frescos y remueve exceso células, creando así un crecimiento más uniforme y subproductos metabólicos medio ambiente. En condiciones de constante crecimiento, se observan comportamientos celulares en aislamiento de la influencia de factores ambientales, que permite una vista sin obstáculos de la lógica interna de las células. Como el fluido evita que el dispositivo de microfluidos cada vez lleno de células, observación de los linajes de la célula para decenas o cientos de generaciones se convierte en posible4,5. Los tiempos de observación largos permiten la detección de comportamientos de otra manera imperceptible celular a largo plazo o rara. Finalmente, la composición del medio que fluye a través del dispositivo puede modificarse a voluntad, permitiendo que las células a observar como responden a la aparición de un estrés o a la introducción o extracción de un compuesto particular.
Microfluídica ya ha disfrutado de una serie de aplicaciones importantes. Por ejemplo, se ha utilizado en tejido, órgano o cuerpo-en-un-chip de dispositivos, en el que varios tipos de células humanas se cultivan conjuntamente para simular un en vivo condición6; para el estudio de nematodos movimiento en entornos microestructurada7; examinar las interacciones entre biopelículas bacterianas (p. ej., 8); y para la encapsulación y la manipulación de volúmenes pequeños de las células o sustancias químicas (p. ej., 9). Dispositivos microfluídicos también han hecho cada vez más populares en el campo de la microbiología (por excelentes críticas, véase 10 y 11), especialmente como su físico y las propiedades de flujo son bien emparejados a nichos microbianos naturales12. Por ejemplo, microfluídica ha sido recientemente empleada por microbiólogos para tales fines como célula crecimiento y la división13,14,15, análisis de movimiento del patógeno16, que mide precisamente control de detección de quórum17 y18de las transiciones fisiológicas y para la proteína contando19, entre muchos otros ejemplos. El método presentado aquí está diseñado específicamente para el análisis de los linajes de la célula bacteriana en lugar de combinaciones de cepas o especies. El dispositivo de microfluidos demostrado aquí utiliza una variación de la “máquina de la madre” diseño4, en el cual las células se cultivan solo archivo dentro de una zanja de microfluidos con un extremo cerrado y un extremo abierto; División y crecimiento celular empuja a las células de la progenie arriba y hacia afuera el extremo abierto en el fluido. Los análisis suelen centran sólo en la célula “madre” que se limita en el extremo cerrado de la zanja. Consideramos este método como un adelanto sobre anteriores luz basadas en microscopia sola célula técnicas analíticas, tales como inmovilización de células en agarosa almohadillas. Mientras que B. subtilis se utiliza como un modelo, el método es también aplicable a otras especies bacterianas (Escherichia coli es otro modelo común, algunas especies con células diferentes tamaños y morfologías pueden requerir la fabricación de nuevos dispositivos con diferentes dimensiones). El uso de reporteros fluorescentes para marcar las células y visualizar los cambios en la expresión génica requiere el uso de especies genéticamente manejables; sin embargo, los análisis de morfología y crecimiento de la célula son posibles incluso sin marcadores fluorescentes.
El presente Protocolo excluye el proceso de fabricación del maestro de silicio mediante Fotolitografía, que ha sido ampliamente descrito en otra parte5; maestros también pueden ser fácilmente subcontratados de microfabricación instalaciones. Incluye el moldeado de un dispositivo PDMS de un maestro de silicio reforzada; vinculación el dispositivo a un pedazo de vidrio de la cubierta; montaje de la entrada de microfluidos y tubería de salida, válvulas de pellizco incluido para permitir el cambio de medio; apaciguando el dispositivo, preparar células bacterianas y cargar el dispositivo con las células bacterianas; al conectar las tuberías para el dispositivo y equilibra las células; y cargar el dispositivo en un microscopio de fluorescencia para la proyección de imagen. Porque muchos de imagen diferente de adquisición y procesamiento software herramientas pueden utilizarse para visualizar y analizar diferentes datos de interés4,5, se muestran imágenes de ejemplo, pero los métodos de captura de imagen no están incluidos en este protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de la microfluídica es flexible en que muchos de los pasos pueden ser modificados para optimizar su uso con una determinada especie o cepa o para un propósito específico. De hecho, en este protocolo hemos hecho modificaciones a la “máquina de la madre” original concepto de4 para optimizar su uso con B. subtilis. A menudo, las trincheras que se limitan las células constituyen una característica de una sola capa, mientras que en el presente Protocolo utilizan zanjas de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por los institutos nacionales de salud en GM018568. Este protocolo fue realizado en parte en el centro de sistemas de nanoescala (CNS), un miembro de la nacional nanotecnología coordinada infraestructura red (NNCI), que es apoyado por la National Science Foundation bajo premio NSF no. 1541959. CNS es parte de la Universidad de Harvard. Muchas gracias son debido a Thomas Norman y Nathan Lord por su trabajo en la concepción y fabricación de la plantilla principal utilizada para los dispositivos que se muestra aquí y en la construcción de la versión original del aparato. También agradecemos sus valiosos consejos de colaboración de Johan Paulsson y gracias a los miembros de su laboratorio para su asesoramiento y mejoras continuas para aparatos de microfluidos bacteriana.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
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