Encelliga mikroflödessystem analys av Bacillus subtilis
Summary
Vi presenterar en metod för mikroflödessystem analys av enskilda bakteriecell härstamningar med Bacillus subtilis som exempel. Metoden övervinner brister av traditionella analytiska metoder i mikrobiologi genom att låta observation av hundratals cell generationer tätt kontrollerbar och enhetlig tillväxt villkor.
Abstract
Mikroflödessystem teknik övervinner många av begränsningar för traditionella analytiska metoder i mikrobiologi. Till skillnad från bulk-kultur metoder erbjuder det encelliga upplösning och lång observation tider som spänner över hundratals generationer. till skillnad från agaros pad-baserade mikroskopi har den enhetlig tillväxt villkor som kan kontrolleras noggrant. Eftersom ett kontinuerligt flöde av odlingsmedium isolerar cellerna i en mikroflödessystem enhet från oförutsägbara variationer i lokala kemiska miljön som orsakas av celltillväxt och metabolism, autentiska förändringar i genuttryck och celltillväxt i svar på specifika stimuli kan observeras mer tillförsikt. Bacillus subtilis används här som en modell bakterieart att demonstrera en ”mor maskin”-Skriv metod för cellulära analys. Vi visar hur du konstruera och lod en mikroflödessystem enhet, ladda den med celler, initiera mikroskopbilder och exponera celler till en stimulans genom att byta från ett odlingsmedium till en annan. Stress-lyhörd reporter används som ett exempel för att avslöja vilken typ av data som kan erhållas genom denna metod. Vi diskuterar också kort ytterligare tillämpningar av denna metod för andra typer av experiment, såsom analys av bakteriell sporulering.
Introduction
En av de mest slående funktionerna av liv på jorden är dess stor motståndskraft och mängd. Ett centralt mål för molekylärbiologi är att förstå logiken som celler använder gener och proteiner för att maximera sin tillväxt och kondition under en mängd olika miljöförhållanden. För att uppnå detta mål, måste forskarna kunna tryggt Observera hur enskilda celler växer, dela och uttrycka sina gener under en given uppsättning villkor, att notera hur celler svarar på ändringar i deras miljö. Traditionella analytiska metoder i mikrobiologi har dock tekniska begränsningar som påverkar vilka typer av frågor som kan lösas. Till exempel bulk kultur-baserade analyser har varit mycket användbar under åren, men de erbjuder bara befolkningen nivå data som kan maskera meningsfull cell till cell variationer eller beteenden av mindre delpopulationer av celler i den totala befolkningen. Enskild cell analyser av levande bakterier baserat på ljusmikroskopi avslöja encelliga beteende men är också tekniskt begränsad. Bakterier är oftast orörlig på agaros pads som innehåller odlingsmedium, men cell tillväxt och division folkmassorna vyn mikroskopiska och utarmar de tillgängliga näringsämnena efter bara några cell cykler, att avsevärt begränsa observation tid1, 2. Dessutom förändras lokala utarmning av näringsämnen och samtidig uppbyggnad av metaboliska biprodukter på grund av celltillväxt ständigt lokala cell tillväxt miljön på ett sätt som är svåra att mäta eller förutsäga. Sådana miljöförändringar som använder agaros kuddar utgör en utmaning att studier av steady state beteenden eller cellulära svar för vissa förändringar i tillväxt villkor3.
Mikroflödessystem teknik, där ett flytande medium kontinuerligt flödas igenom biochips enheter, erbjuder en lösning till klassiska experimentella begränsningar. En mikroflödessystem enhet kan hålla enskilda celler i position för live-cell mikroskopi medan flödet av odlingsmedium ständigt ger celler med färskt näringsämnen och tvättar bort metaboliska biprodukter och överskjutande celler, vilket skapar en mycket jämn tillväxt miljö. Under ständig tillväxt villkorar, kan cell beteenden observeras i isolering från påverkan av miljöfaktorer, tillåter en obehindrad utsikt över den inre logiken av celler. Strömningen förhindrar mikroflödessystem enheten från att bli trångt med celler, blir observation av enstaka cell härstamningar för tiotals eller hundratals generationer möjligt4,5. Sådan lång observation gånger möjliggöra upptäckt av annars omätbara långsiktiga eller sällsynta cell beteenden. Slutligen kommer sammansättningen av det medium som strömmar genom enheten kan ändras på, så att celler observeras när de svarar till uppkomsten av en stress eller införande eller borttagning av en särskild förening.
Mikrofluidik har redan haft ett antal viktiga tillämpningar. Till exempel, har det använts i vävnad-, orgel- eller organ-på-ett-chip enheter, där flera typer av mänskliga celler är samtidig odlade att simulera en i vivo villkor6. för studier av nematoder rörelse i microstructured miljöer7; att undersöka interaktionen mellan bakteriell biofilm (t.ex., 8); och för inkapsling och manipulation av små volymer av celler eller kemikalier (t.ex. 9). Mikroflödessystem enheter har också blivit allt populärare inom mikrobiologi (för utmärkt recensioner, se 10 och 11), särskilt som deras fysiska och flödet egenskaper är väl matchade till naturliga mikrobiella nischer12. Exempelvis har mikrofluidik nyligen anställts av mikrobiologer för sådana ändamål som just mäta cell tillväxt och division13,14,15, analysera patogen rörelse16, övervakning quorum sensing17 och fysiologiska övergångar18, och för protein räknar19, bland många andra exempel. Metoden presenteras här är specifikt utformad för analys av enda bakteriecell härstamningar i stället för kombinationer av stammar eller arter. Den mikroflödessystem enheten visat här använder en variant av den ”mor maskin” design4, där celler odlas ENFILIG inom en mikroflödessystem dike med en sluten och en öppen ände; celltillväxt och division skjuter avkomma celler upp och ut ur den öppna änden i strömningen. Våra analyser fokuserar oftast bara på cellen ”mor” som är begränsad i slutna slutet av diket. Vi anser denna metod som en befordran över tidigare Ljus microscopy-baserade encelliga analysmetoder, såsom cell immobilisering på agaros trampdynor. B. subtilis används som modell här, metoden är också tillämpliga på andra bakteriearter (Escherichia coli är en annan gemensam modell, vissa arter med olika cell storlekar eller morfologier kan kräva tillverkning av nya enheter med olika dimensioner). Fluorescerande reportrar att markera celler och att visualisera förändringar i genuttryck förutsätter att användningen av genetiskt eftertraktansvärda arter; analyser av celltillväxt och morfologi är dock möjlig även utan fluorescerande markörer.
Protokolls exkluderar processen att fabricera kisel befälhavaren använder photolithography, som har beskrivits utförligt någon annanstans5; Masters kan också enkelt utlagda från mikrofabrikation faciliteter. Den innehåller gjutning av en PDMS enhet från en förstärkt silicon mästare; bonding enheten till en bit av omslaget glas; montering i ultrakalla inlopp och utlopp VVS, ventiler inklusive nypa för att tillåta medium byta; passivering enheten, förbereda bakterieceller och laddar enheten med bakterieceller; koppla VVS till enheten och equilibrating celler; och laddar enheten på fluorescens Mikroskop för avbildning. Eftersom många olika bild förvärv och bearbetning programvara verktyg kan användas för att visualisera och analysera olika data av intresse4,5, exempel bilder visas, men Bildinsamling metoder ingår inte i detta protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta mikrofluidik protokoll är flexibel i att många av stegen kan ändras för att optimera dess användning med en särskild art eller stam eller för ett specifikt syfte. Vi har faktiskt gjort ändringar av den ursprungliga ”mor maskin” concept4 att optimera dess användning med B. subtilisi detta protokoll. Skyttegravarna där cellerna är begränsade utgör ofta en enlagers funktion, medan i detta protokoll använder vi två-lagers cell diken, med ett grunt kanal som omger cell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har finansierats av National Institutes of Health under GM018568. Detta protokoll utfördes delvis på Center för nanoskala system (CNS), en medlem av den nationella nanoteknik samordnad infrastruktur Network (NNCI), som stöds av National Science Foundation under NSF award nr 1541959. CNS är en del av Harvard University. Många tack är på grund av Thomas Norman och Nathan Herre för deras arbete med att utforma och tillverka huvudmallen används för de enheter som visas här och bygga den ursprungliga versionen av apparaten. Vi tackar Johan Paulsson för hans värdefulla collaborative råd och tacka medlemmarna i hans labb för deras råd och fortsatta förbättringar av bakteriell mikroflödessystem apparaturar.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial “lobster traps”. MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O’Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
