Direkte neuronale Umprogrammierung erzeugt Neuronen, die im Alter von der somatischen Startzelle beibehalten. Hier beschreiben wir eine einzelne Vektor-basierte Methode um induzierte Neuronen von dermalen Fibroblasten von Erwachsenen menschlichen Spendern erhalten zu generieren.
Induzierte Neuronen (iNs), das Produkt der somatischen Zellen direkt in Neuronen, konvertiert sind eine Möglichkeit, Patienten abgeleitet Neuronen aus Gewebe zu erhalten, die leicht zugänglich ist. Auf diesem Weg erhalten Sie in einer Angelegenheit von ein paar Wochen Reifen Neuronen. Hier beschreiben wir eine unkomplizierte und schnelle ein-Schritt-Protokoll um iNs von dermalen Fibroblasten durch Biopsie Proben von Erwachsenen menschlichen Spendern erhalten zu erhalten. Wir erklären jeden Schritt des Prozesses, einschließlich der Wartung der dermalen Fibroblasten, das Einfrieren Verfahren, einen Vorrat an der Zell-Linie zu bauen Aussaat für Neuprogrammierung der Zellen sowie die Kulturbedingungen während des Konvertierungsvorgangs. Darüber hinaus beschreiben wir die Vorbereitung der Glasdeckgläser für elektrophysiologische Aufnahmen, langfristige Ansatzbedingungen und Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS). Wir zeigen auch Beispiele für die Ergebnisse zu erwarten sind. Das hier beschriebene Protokoll ist einfach durchzuführen und können an den menschlichen Fibroblasten aus Menschenhaut Biopsien von Patienten mit verschiedenen unterschiedliche Diagnosen und Alter abgeleitet werden. Dieses Protokoll generiert eine ausreichende Menge an iNs, die für eine breite Palette von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich Krankheit Modellierung, Drogen-Screening und Target-Validierung verwendet werden können.
Entwicklung wirksamer Behandlungsmethoden für neurologische Erkrankungen wurde durch den begrenzten Zugang zu lebenden menschlichen Gehirnzellen mechanistische Studien und funktionelle Assays durchführen behindert. Vor über einem Jahrzehnt änderte sich diese Situation radikal mit der Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) Technologie1,2. Dies, kombiniert mit einem besseren Verständnis der neuronalen Differenzierung Mechanismen auftreten während der normalen menschlichen Entwicklung hat für die Erzeugung von definierten und diverse neuronale Subtypen von Patient und Krankheit bestimmtes Material erlaubt. Mit diesem Material ist es jetzt möglich intrazelluläre Mechanismen, neurologischen Erkrankungen und das Potenzial der verschiedenen Verbindungen zur Linderung dieser pathologischen Funktionen3zu studieren.
Während iPSCs revolutionären auf dem Gebiet der Neurowissenschaften wurden, ist ein großer Nachteil dieser Zellen, dass ihre alternden Unterschrift bei der Neuprogrammierung so gelöscht, dass verjüngte Neuron die Sicherheitsanfälligkeit zugeordnet nicht beibehält Aging-4,5,6. Diese Besonderheit der Neuronen, die produziert werden kann Ende wird für viele Aspekte der intrazellulären pathogenen Kaskade, insbesondere bei Krankheiten, bei denen das Alter ein wichtiger Risikofaktor ist, Rekapitulation von entscheidender Bedeutung.
Direkte neuralen Neuprogrammierung ist eine Technologie, wo eine somatische Zelle direkt in umgewandelt wird, ein iN ohne den Umweg über eine pluripotente fortgeschrittene Stadium. Dies ermöglicht eine schnelle Generierung von menschlichen Neuronen in Vitro , die geduldig und spezifische Krankheit sein können. Eine bemerkenswerte Eigenschaft der direkte Reprogrammierung ist, dass die ab Alter der Spender Zelle wird beibehalten, und damit seine Anfälligkeit für Alterungsprozesse wie z. B. Produktion von oxidativem Stress4,7 erhöhte. Infolgedessen iNs von Patienten mit neurologischen Erkrankungen mit Altern verbunden, wie Alzheimer und Parkinson, eignen sich gut für ein breites Spektrum von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich Krankheit Modellierung, Drogen-screening-Assays und toxikologischen Untersuchungen .
Die wichtigste Einschränkung, die iNs gehindert hat Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wird am meisten benutzt ist, dass sie nicht einfach sind zu programmieren, und dies noch schwieriger mit Ausbau der Fibroblasten wird. Infolgedessen wurde Generation der iN den Zellen für diese Arten von Anwendungen benötigten Mengen nicht bis vor kurzem nur8erreicht. Wir haben jetzt eine einfache Methode um Fibroblasten von Spendern jeden Alters sehr effizient programmieren entwickelt. Diese Methode verbindet die erzwungene Ausdruck der neuronalen Transkriptionsfaktoren, Ascl1 und Brn2 mit einem Zuschlag von Repressor-Protein RE1-silencing Transkriptionsfaktors (REST) mit einem einzigen Vektor. Hier beschreiben wir die einzelnen Schritte führt zu der Generation von iNs aus Haut Fibroblasten biopsiert von älteren Spendern umgewandelt.
Diese one-step/One-Vektor Umprogrammierung Methode bietet eine effiziente Möglichkeit, iNs von menschlichen Erwachsenen Fibroblasten zu erhalten. Menschliche Erwachsenen Fibroblasten sind normalerweise sehr viel schwieriger zum Versteck als fetaler Fibroblasten, mit begrenzten Studien zuvor Berichterstattung Wirkungsgrade von ca. 5-10 %12,13. Mit dieses neue Protokoll ist es jedoch möglich, eine neuronale Ausbeute (gemessen als MAP2 +-Zellen) von ca. 50 %8zu erreichen. Darüber hinaus kann unser Protokoll auf dermalen Fibroblasten verwendet werden, die mehrere Male passagiert wurden, ohne die Effizienz der Umwandlung. Bisher haben wir Zellen passagiert bis zu 14-Mal ohne Erkennung Abnahme der Wirkungsgrad verwendet. Darüber hinaus gibt es keinen Unterschied in der Umprogrammierung Effizienz in unseren Händen mit Fibroblasten von Spendern im Alter zwischen 52 und 87. Für weitere Informationen über das Alter und Krankheit von anderen Zelllinien getestet mit diesem Konstrukt siehe Referenz8. Andere Studien haben auch keinen Unterschied im Wirkungsgrad mit einem Lentivirale-basierte und kleine Molekül-erweiterte Protokoll mit Gebern zwischen 0 und 89 Jahren4berichtet. Darüber hinaus hat einheitliche Anwendbarkeit mit MiRNA-basierte neuronalen Umprogrammierung in Fibroblasten aller Altersgruppen, mit Gebern zwischen 0 und 86 Jahren7gemeldet. Auf diesem Weg erhalten Sie in ca. 12-15 Wochen in Vitro oder ca. 8 Wochen nach der Transplantation in Vivo8Reifen Neuronen. Dies ist vorteilhaft, weil es Zugang zu Krankheit und Patient gibt einzelne menschliche iNs aus Gewebe, das leicht zugänglich ist. Obwohl dieses Protokoll effizient ist, es wird keinen 100 % neuronalen Ertrag produzieren, und als solche ein Reinigungsschritt, zum Beispiel mit FACS ist erforderlich.
Die wichtigste Schritt im Rahmen dieses Protokolls wird virale Transduktion (Protokoll Abschnitt 4). Es ist entscheidend, dass der Virustiter präzise, zusätzlich eine genaue Anzahl von aHDFs für die Konvertierung überzogen haben. Die empfohlene Titer für die Verwendung mit diesem Protokoll ist zwischen 4 x 10-8 und 4 x 10-9. Mit einem Titer von etwas unter 1 x 108 würde nicht empfohlen werden, wie das hinzufügen, dass große Mengen des Virus in die Zellen giftig sein werden. Darüber hinaus werden beginnen die Fibroblasten zu konvertieren iNs sie zerbrechlich und anfällig für anheben. Es ist wichtig, sanft sein, wenn die Medien nicht zu stören die Zellen zu viel verändert. Dies kann durch das Entfernen der Flüssigkeit langsam mit einer 1.000 µL Pipette. Beschichtung für eine Anpassung (Protokoll Abschnitt 3) ist es schließlich wichtig, eine gesunde Fibroblasten Bevölkerung vor Beginn ein Experiment zu gewährleisten; Dies wird durch eine Zellviabilität von über 90 % mit Trypan blau zu färben. Der aHDFs sollte immer vor erreichen 95 % Konfluenz passagiert werden.
Gibt es spürbare Zelltod vor virale Transduktion, Konvertierung nicht beginnen: Überprüfen Sie, dass die Zellviabilität über 90 % liegt, gab es keine Probleme mit der Beschichtung der Platte. Es wird erwartet, eine kleine Menge von Zelltod nach virale Transduktion, dies sollte jedoch nicht erheblich sein. In diesem Fall bestätigen Sie präzise Aussaat von 50.000 aHDFs/gut und überprüfen Sie der Virustiter zu. Wenn es spürbar Inkonsistenz zwischen Brunnen während der Konvertierung, prüfen Sie zunächst, dass jeder Brunnen einer gleichen Menge von Medien enthält und offene Verdunstung sich nicht an den Rändern vollzieht (wenn die Kante Brunnen erforderliche zusätzliche Medien hinzugefügt werden können). Alternativ überprüfen Sie Schritt 4.4 und sicherstellen Sie, geeignet für eine homogene Suspension mischen, wenn transducing. Es ist entscheidend für die Lentivirus zunächst auf das Medium hinzufügen, bevor man diese in die Vertiefungen. Hinzufügen von Lentivirus direkt in die Vertiefungen steigen Variabilität von Brunnen zu Brunnen und dürfte auch für die Zellen toxisch sein. Zu guter Letzt überprüfen Sie immer, dass das Medium auf 37 ° C erwärmt wird, bevor Sie Zellen hinzufügen.
Dieses Protokoll enthält optionale Abschnitte für Ansatzbedingungen für lange Begriff Kultur iNs und FACS sortieren um neuronale Reinheit zu erhöhen. Für Experimente, die funktionelle Charakterisierung von iNs untersuchen möchten wurde ein Protokoll für die Vorbereitung der Glasdeckgläser für Elektrophysiologie auch aufgenommen. Die Umwandlung Protokoll hier wird für die Verwendung mit einer 24-Well-Platte eingerichtet; Falls gewünscht, dies kann geändert werden, um eine 6-, 12-, 48-, 96-Well-Platte oder Flaschen. In diesem Fall passen Sie alle Volumes auf die Oberfläche der Platte oder Kolben genutzt.
Dieses Protokoll verwendet der erzwungene Expression von Ascl1 und Brn2 in Kombination mit einer REST-Knockdown alle verpackt in einem einzigen Vektor8 iNs von Pan-neuronalen Phänotyp erzeugen. Die Generation der alle glialen Untertypen mit dieser Methode ist jedoch nicht bewertet worden. Somit muss diese Methode für die Verwendung mit anderem Neuprogrammierung Subtyp spezifische Neuronen zu erhalten geändert werden. Direkte Reprogrammierung hat zuvor die Möglichkeit zu motorischen Neuronen, sensorischen Neuronen, Photorezeptoren, mittelgroßen bedornten striatalen Neuronen und dopaminergen Neuronen10,14gezeigt. Dies ist vorteilhaft bei der Untersuchung von neurologischer Erkrankungen, welche spezifischen neuronalen Subtyp sind bevorzugt betroffen, für Beispiel Parkinson und dopaminergen Neuronen.
Bis vor kurzem direkten neuralen Neuprogrammierung Technologie war es nicht möglich für die Herstellung von iNs in eine einheitliche und effiziente Weise – auf einem Niveau, das für Toxikologie und Drogen-screening-Tests in großem Maßstab erforderlich ist. Diese neue Methode ist sehr effizient und kann auf Fibroblasten, die viele Male passagiert wurden haben, so dass es jetzt diese Einschränkungen entfernt und eröffnet eine Vielzahl von Studien, nicht nur im menschlichen Nervensystem, sondern auch in ein System, das bestimmte Patienten kann verwendet werden. Die Einfachheit dieses Ansatzes rendert die iN Technologie zugänglich für alle Gruppen, die ähnliche Studien Inhouse durchführen wollen und kann leicht verwendet werden nicht nur für große biomedizinischen Anwendungen, wie Drogen-Screening und Toxikologie-Tests, sondern auch zur Unterstützung Daten aus Tiermodellen und menschliche post-mortem Gewebeproben abgeleitet.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Marie Persson Vejgården für technische Hilfe. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell unterstützt von der New York Stem Cell Foundation, der Europäische Forschungsrat siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union: FP/2007-2013 Neuro Stem Cell Repair (Nr. 602278) und ERC-Grant Agreement keine. 30971, der schwedischen Forschungsrat (Finanzhilfevereinbarung 521-2012-5624, 2016-00873 und 70862601 / Bagadilico), schwedische Parkinson Foundation (Parkinsonfonden) und Bereich strategische Forschung an der Lund Universität Multipark (multidisziplinäre Forschung im Parkinson Erkrankung). Janelle Drouin-Ouellet wird unterstützt durch ein Stipendium der kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR) (#358492), und Roger Barker wird unterstützt durch ein Stipendium NIHR Biomedical Research Centre an der Universität von Cambridge/Addenbrooke Krankenhaus. Malin Parmar ist ein New York Stem Cell Stiftung Robertson Ermittler. Shelby Shrigley wird vom Programm Europäischen Union Horizont 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) unter dem Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network und Grant Agreement Nr. 676408 finanziert.
Cell Lines | |||
Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old male. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
Milli-Q Water | Millipore | ||
Basal medium – Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
Neural differentiation medium – NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
Reagents for Coatings | |||
Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
Cell dissociation agent – Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, – phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
Reagents for Glass Coverslips | |||
Autoclaved deionized water | |||
Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
Ethanol 95% | |||
Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
Reagents for Immunocytochemistry | |||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
Equipment | |||
T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 – 1,000 µL. | ||
Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
Parafilm M | VWR | ||
ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
Laminar flow hood | |||
Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
Orbital shaker | |||
Sonicator – Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |