Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster

Sommario

Raccogliendo la prova sostiene l'idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula--cellula diffusione del prione-come i complessi nell'organismo modello, Drosophila melanogaster.

Abstract

L'aggregazione della proteina è una caratteristica centrale della maggior parte delle malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Aggregati proteici sono strettamente associati con neuropatologia in queste malattie, anche se non è noto l'esatto meccanismo attraverso il quale l'aggregazione di proteine aberranti sconvolge la normale omeostasi cellulare. Emergendo dati forniscono l'appoggio importante per l'ipotesi che aggregati patogeni in AD, PD, HD e ALS hanno molte somiglianze ai prioni, che sono agenti infettivi sola proteina responsabili per le encefalopatie spongiformi trasmissibili. I prioni auto-replicano di templating la conversione delle versioni piegato in modo nativo della stessa proteina, causando la diffusione del fenotipo aggregazione. Come i prioni e proteine prioniche-like in annuncio, PD, HD e ALS mossa da una cellula a altra è attualmente un'area di intensa ricerca. Qui, è descritto un modello di Drosophila melanogaster che permette il monitoraggio della trasmissione del prion-like, cellula--cellula di aggregati di huntingtina (Htt) connesso con HD. Questo modello si avvale di strumenti potenti per manipolare l'espressione del transgene in molti tessuti differenti di Drosophila e utilizza una proteina citoplasmatica fluorescente contrassegnati al direttamente del prion-come trasferimento del rapporto di mutante Htt aggregati. D'importanza, l'approccio che descriviamo qui può essere utilizzato per identificare nuovi geni e vie che mediano la diffusione degli aggregati della proteina tra cellulari diversi tipi in vivo. Informazioni acquisite da questi studi si espanderà la limitata comprensione dei meccanismi patogenetici che sono alla base di malattie neurodegenerative e rivelare nuove opportunità per intervento terapeutico.

Introduzione

L'ipotesi del prion afferma che l'agente infettivo responsabile per le encefalopatie spongiformi trasmissibili (ad es., malattia di Creutzfeldt – Jakob in esseri umani, scrapie nelle pecore, malattia del deperimento cronico in cervi e alci e "malattia della mucca pazza" nei bovini ) è esclusivamente composto di proteine e privo di acidi nucleici¹. In malattie da prioni, la proteina prionica cellulare (PrP^C) assume una piega non nativi, stabile (PrP^Sc) che è altamente beta foglio-ricco e auto-propagarsi convertendo e reclutamento monomerico PrP^C molecole in amiloide stabile funzioni di aggregazione. PrP<....

Protocollo

1. giunto Gal4 e QF-ha mediato l'espressione del Htt Transgene in Drosophila

1. Raccogliere e/o generare transgenici di Drosophila melanogaster righe contenenti tessuto-specifici Gal4 o QF "driver", come pure le righe contenenti transgeni Htt wild-type o mutanti a valle del Gal4-UAS³⁸ o³⁹di QF-QUAS. Garantire che le proteine che vengono espresse da questi transgeni sono fuse a proteine fluorescenti o epitopo-etichetta per consentire per la differenziazione dei mutanti e wild-type Htt transgene prodotti al volo stesso. Vedere la Figura 1.
   Nota: In genere usiamo fra....

Risultati

I metodi descritti qui produrranno dati affidabile dimostrando del prion-come trasferimento di aggregati proteici Htt dalla popolazione di una cella a altra nel fly intatto CNS. Conversione di selvaggio-tipo Htt da diffusa a punctate è osservata da fluorescenza diretta di questa proteina di fusione di YFP nel destinatario glia come risultato HttQ91-mCherry espressione nel donatore ORNs (Figura 2A-C e Figura 4

Discussione

Come i numeri dei pazienti affetti da malattie neurodegenerative continua ad aumentare, c'è un urgente bisogno di aumentare la comprensione della patogenesi molecolare di queste malattie, in modo che possono essere sviluppate terapie migliori. Qui, descriviamo i metodi che consentono il monitoraggio del prion-come trasmissione degli aggregati della proteina patogena tra diversi tipi di cellule nell'organismo modello, Drosophila melanogaster. Recentemente abbiamo utilizzato questa metodologia per dimostrare da pr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10X, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Diluire a 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Scientific	2904F24
20% paraformaldeide (PFA)	Microscopia elettronica Sciences	15713-S
Siero di capra normale (NGS),	lampiro filtrato Laboratori biologici	7332500	Aliquotare e congelare al ricevimento
Pollo anti-GFP	Aves Labs	GFP-1020	Utilizzare a diluizione 1:500
Coniglio anti-DsRed	Clontech	632496	Utilizzare a diluizione 1:2000; è in grado di riconoscere proteine fluorescenti a base di DsRed (ad es. mCherry, mStrawberry, tdTomato, ecc.)
Topo anti-Bruchpilot	Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank	nc82	Utilizzare a diluizione 1:100; etichetterà le strutture pre-sinaptiche attive in tutto il cervello del moscerino
FITC anti-pollo	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Utilizzare a diluizione 1:250
Alexa Fluor 568 anti-coniglio	Life Technologies	A11011	Utilizzare a diluizione 1:250
Alexa Fluor 647 anticorpo anti-topo	Life Tecnologie	A21235	Uso a diluizione 1:250
Reagente antisbiadimento Slowfade Gold	Life Technologies	S36936
Vetrini per microscopio (25 x 75 x 1,0 mm)	Fisher Scientific	12-550-143
Vetro di copertura (22 x 22 mm)	Globe Scientific	1404-15
Dumont Biology Grade Pincipe, stile 3	Ted Pella	503	uso in mano non dominante
Pinza Dumont Biology Grade, Stile 5	Ted Pella	505	uso nella mano dominante
Software di analisi delle immagini LAS X Software di analisi delle immagini	Leica
Imaris	Bitplane