Acumulación de evidencia apoya la idea de que agregados de proteína patógena asociada a enfermedades neurodegenerativas entre células con propiedades similares a los priones. Aquí, describimos un método que permite la visualización de la propagación de célula a célula del prion-como los agregados en el organismo modelo Drosophila melanogaster.
Agregación de la proteína es una característica central de la mayoría las enfermedades neurodegenerativas, como esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Huntington (HD). Agregados de proteína están estrechamente asociados con neuropatología en estas enfermedades, aunque no se conoce el mecanismo exacto por el cual la agregación de la proteína aberrante interrumpe homeostasis celular normal. Surgiendo datos proporcionar fuerte apoyo para la hipótesis de patógenos agregados en TDA, PD, y ALS tienen muchas similitudes a los priones, que son sólo proteínas agentes infecciosos responsables de las encefalopatías espongiformes transmisibles. Priones autoreplicarse por plantillas la conversión de forma nativa doblado versiones de la misma proteína, causando la propagación del fenotipo de agregación. Cómo los priones y las proteínas del prión-como en AD, PD, HD y ALS se mueven de una celda a otra es actualmente un área de intensa investigación. Aquí, se describe un modelo de Drosophila melanogaster que permite monitoreo de transmisión del prión-como, célula a célula de agregados de la huntingtina (Htt) asociados con el HD. Este modelo se aprovecha de potentes herramientas para manipular la expresión de transgenes en muchos diversos tejidos de Drosophila y utiliza una proteína citoplásmica fluorescencia etiquetada transferencia directamente de prion-como del informe de agregados Htt mutantes. Lo importante, el enfoque se describe aquí puede utilizarse para identificar nuevos genes y vías que median la separarse de agregados de proteína entre célula diversos tipos en vivo. Información obtenida de estos estudios será ampliar la limitada comprensión de los mecanismos patogénicos que subyacen a las enfermedades neurodegenerativas y revelar nuevas oportunidades para la intervención terapéutica.
La hipótesis del prión afirma que el agente infeccioso responsable de las encefalopatías espongiformes transmisibles (p. ej., enfermedad de Creutzfeldt – Jakob en los seres humanos, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en ciervos y alces y “enfermedad de las vacas locas” en bovinos ) está exclusivamente compuesto de proteína y desprovista de ácidos nucleicos1. En enfermedades por prión, la proteína priónica celular (PrPC) asume un pliegue (PrPSc) no nativos, estable que es altamente beta ricos en hoja y puede uno mismo-propagar por conversión y reclutar moléculas monoméricas de PrPC en amiloide estable agregados. Agregados de PrPSc utilizan este mecanismo uno mismo-repliegue para difundir entre las diferentes células en un organismo e incluso entre los organismos individuales2.
Agregación y mal plegamiento de la proteína también es una característica central de la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y esclerosis lateral amiotrófica (ELA))3. Formación de asambleas de cellular intra o extra proteína agregada en estas enfermedades está íntimamente relacionada con la citotoxicidad4 y progresa a lo largo de caminos altamente reproducibles y específica de la enfermedad a través del cerebro en tiempo5, 6. estos patrones de propagación sugieren que agregados patógenos asociados con estos trastornos tienen propiedades similares a los priones. Ahora existe fuerte apoyo para transmisión del prión-como de agregados asociados a AD, PD, HD y la ELA – transmite de célula a célula y la plantilla el cambio conformacional de la forma monomérica de la misma proteína en células previamente inafectados7, 8.
La mayoría de los estudios que investigan propagación de prion-como de agregados de proteínas hasta la fecha se han realizado utilizando modelos de cultivo de células de mamífero, donde transferencia de agregados en el citoplasma de las células ingenuas desde el espacio extracelular o desde otra celda citoplasma9,10,11,12,13,14,la15, o por inyección de material que contiene el agregado en cerebros de ratón y control agregado apariencia fuera la inyección sitio16,17,18,19,20,21,22, 23. más recientemente, se han utilizado animales transgénicos para demostrar que agregados intracelulares se extensión a otras células en el cerebro intacto24,25,26,27, 28,29,30. Aquí, describimos un método para la visualización directa de la transferencia total entre las células individuales del cerebro intacto de Drosophila melanogaster. En primer lugar se desarrollaron modelos de Drosophila de HD/polyglutamine (poliQ) enfermedades hace casi dos décadas31,32 y han proporcionado muchos conocimientos invaluables en los mecanismos patogénicos que subyacen a estos trastornos 33. HD es un trastorno neurodegenerativo hereditario causado por una mutación dominante autosómica en el gen que codifica para la proteína huntingtina (Htt)34. Esta mutación da lugar a la ampliación de un tramo de la poliQ cerca N-terminal de Htt, más allá de un umbral patógeno de ~ 37 glutaminas, haciendo que la proteína misfold y agregado35,36. Proteínas de Htt de tipo salvaje que contienen < 37 glutaminas en este tramo lograr su pliegue natural, pero puede ser inducidas a agregado al contacto físico directo con un Htt agregada "la semilla"12,27,37. Aprovechamos este homotípicos, nucleada agregación de Htt de tipo salvaje como una lectura para transferencia-como prión y entrada citoplasmática de agregados de Htt mutantes procedentes de otras células.
Determinar los mecanismos por los que agregados-como prión viajes entre células pueden conducir a la identificación de nuevas dianas terapéuticas para enfermedades neurodegenerativas incurable. Tomamos ventaja del ciclo de vida rápido, facilidad de uso y maleabilidad genética de Drosophila melanogaster para definir mecanismos moleculares para la propagación de célula a célula de agregados Htt mutantes. Nuestra estrategia experimental emplea dos sistemas de expresión binaria disponibles en Drosophila, la bien establecida Gal4 específicos aguas arriba activar secuencia (Gal4-UAS) sistema38 y el recientemente desarrollado QF-QUAS sistema39. Estos dos sistemas independientes de acoplamiento permite restringir la expresión de los transgenes de Htt mutantes y el salvaje-tipo poblaciones celulares distintas dentro de la misma mosca40. Usando este acercamiento, examinamos prion-como separarse del mutante Htt mediante el control de la redistribución de los citoplásmico Htt de tipo salvaje de su estado soluble, normalmente difuso a un estado agregado, consecuencia directa del contacto físico con una forma mutante Htt agregado “semilla.” Conversión de tipo salvaje Htt por mutante Htt puede confirmarse mediante bioquímica o transferencia de técnicas biofísicas que informe las interacciones proteína-proteína, como la energía de resonancia de fluorescencia (FRET)9,27,41 .
Lo importante, también podemos acceder a un gran número de herramientas genéticas en Drosophila para identificar genes o vías que median la propagación del prión-como de agregados de proteína. Recientemente hemos utilizado este enfoque para desvelar un papel clave para el receptor scavenger superficial, Draper42,43, en la transferencia agregados Htt mutantes de axones neuronales a glia fagocitaria cercana en Drosophila central sistema nervioso (CNS)27. Así, el enfoque basado en la proyección de imagen y genética que se describe aquí puede revelar importante información biológica básica sobre un fenómeno de enfermedad relevante en simple-to-use pero organismo modelo de gran alcance, Drosophila.
Sigue aumentando el número de pacientes que sufren de enfermedades neurodegenerativas, hay una necesidad urgente de aumentar la comprensión de la patogenia molecular de estas enfermedades que se pueden desarrollar mejores terapias. Aquí, describimos los métodos que permiten monitoreo de transmisión del prión-como de agregados de proteínas patogénicas entre diferentes tipos de células en el organismo modelo Drosophila melanogaster. Recientemente hemos utilizado esta metodología para demostrar la transmi…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros de los laboratorios Kopito, Luo y Pearce para muchas discusiones útiles durante el desarrollo de estos métodos. También agradecemos a Brian Temsamrit para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los fondos de la Universidad de las Ciencias y las confianzas caritativas de W.W. Smith.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |