培養ひと胎児脳神経幹細胞の免疫細胞化学的解析のジカ ウイルス感染症
Summary
この記事は、ひと胎児脳神経幹細胞文化だけでなく、様々 な神経細胞やアストロ サイト、ジカ ウイルス感染症を研究する神経幹細胞の使用に重点を置いてにそれらを区別する方法を展開に使用する方法を詳しく説明します。
Abstract
人間の胎児脳神経幹細胞は、人間発達神経生物学の様々 な刺激の影響を研究するユニークな非遺伝子組み換えモデル システムです。むしろ動物モデルまたは遺伝子組み換え多能性細胞を使用するよりも、ひと神経幹細胞は画面薬治療の効果を調べたり、個体差を調べるに効果的な培養システムを提供します。ここでは、様々 な神経細胞やアストロ サイト別プライミング手続きにそれらを区別するために、凍結、回収する、無血清のメディアと文化における人間の胎児脳神経幹細胞を展開に使用する方法について詳細なプロトコルを提供します。これらの細胞。さらに、我々 はジカ ウイルス感染症を勉強する人間の胎児脳神経幹細胞を使用する手順をについて説明します。
Introduction
ジカ (ZIKV) は、性的、または蚊ベクトルネッタイシマカとヒトスジシマカ蚊によって媒介するフラビです。ZIKV は、伝送の容易さのための深刻な公衆衛生の脅威として最近確認され、神経学的症状1を提携します。最も感染妊婦2,3に生まれた胎児の小頭症の開発は、神経学的な影響に関する。小頭症は胎児開発の間に、平均4以下の 2 標準偏差以下のまわりで、出生時、頭は一般的なサイズより小さい神経発達障害です。小さい頭囲ではさまざまな発達の遅れ、発作、ビジョンと難聴、摂食困難など併存疾患一般的が伴われます。
最近の研究は、動物モデルを使用か、誘導多能性幹細胞神経発達5,6,7,8ZIKV 感染症の影響を研究します。これらの研究は、ZIKV、別の種の使用の私達の知識に貢献している、または遺伝子組み換え細胞が時間がかかるかに ZIKV の効果を混同するかもしれない追加の変数を追加5,細胞の神経の開発6,7,8します。 ただし、hNSC 文化、このプロトコルで記述されている非付着 neurosphere 文化特にの難点は、文化は文化9を実施する使用される方法に非常に敏感です。メディア コンポーネント、または培養器の物理的な処理も変更は9セルから反応を引き出すのに十分です。これらの問題に対処するため、胎児の神経幹細胞に及ぼす ZIKV を機械論的に尋問するの in vitroひと胎児脳由来神経幹細胞 (hNSCs) 文化を開発しました。私たちのメソッドを使用して、hNSCs なく表現型変化10以上 80 通路維持されました。さらに、トリソミーなどの染色体の変化がいずれまたは最小11。この hNSC 文化は、非付着 neurosphere 文化として育ちます。神経幹細胞の利点の 1 つは球が二次元文化9に比べて生体内でニッチのより多くの反射は文化のユニークなニッチな環境を作成します。このプロトコルの別の利点は、複数の細胞のタイプから派生できる hNSC 文化 hNSC 生存と分化に関する特定の変数の影響を観察する研究者を有効にします。このプロトコルは、中枢神経系発達や障害に関する機構の質問に答えるために見ている個人に適用されます。次のプロトコルは、ZIKV に感染し、その後分化過程で感染の影響を観察する hNSCs を区別する hNSC 文化を展開する方法について説明します。様々 な種類の脳奇形11に貢献する ZIKV による障害の調査を進めるニューロンに hNSCs を区別するために長期的な使用のための hNSCs を格納するメソッドも含まれています。このプロトコルはまた感染や神経幹細胞の生存と分化の毒素など任意の環境の刺激の影響を理解しようとする研究者を対象と考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
文化、hNSCs を操作することは、さまざまな高スループット薬剤のスクリーニングの10、11,12,14、人間病気のモデリングから目的のために使用できる重要なツールを提供します 15,16,17。多くの質問がどのように人間の胎児…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ジョン s. ダン財団とヒトへの感染と免疫のテキサス大学医学部 (P.W.) の研究所からの資金によって支えられました。
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
Riferimenti
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