Zika-Virus-Infektion der kultivierten menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen für Immunocytochemical Analyse
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Methoden, die verwendet werden, um die menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen in Kultur, sowie zur Unterscheidung in verschiedenen neuronalen Subtypen und Astrozyten, mit einem Schwerpunkt auf den Einsatz von neuronalen Stammzellen Zika-Virus-Infektion zu studieren zu erweitern.
Abstract
Menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen sind eine einzigartige gentechnisch nicht veränderten Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Reize auf menschliche Entwicklungsneurobiologie. Eher als Tiermodell oder gentechnisch veränderten induzierten pluripotenten Zellen verwenden, bieten menschlichen neuronalen Stammzellen ein wirksam in-Vitro -System zu untersuchen die Auswirkungen der Behandlungen, Bildschirm Drogen oder individuelle Unterschiede zu untersuchen. Hier bieten wir ausführliche Protokolle für Methoden zur menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen in Kultur mit serumfreien Medien, um sie in verschiedenen neuronalen Subtypen und Astrozyten über verschiedene Priming Verfahren unterscheiden und Einfrieren und wieder erweitern Diese Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen Zika-Virus-Infektion zu studieren.
Introduction
Zika-Virus (ZIKV) ist ein Flavivirus, sexuell oder durch die Vektoren Mücke Aedes Aegypti und Aedes Albopictus Mücken übertragen. ZIKV wurde vor kurzem als schwere öffentliche Gesundheitsbedrohung wegen seiner Mühelosigkeit der Übertragung identifiziert und neurologische Symptome1angeschlossen. Eines der wichtigsten über neurologische Wirkungen ist die Entwicklung einer Mikrozephalie bei Feten zu infizierten schwangeren2,3geboren. Mikrozephalie ist eine Neurodevelopmental Störung, wo ist der Kopf kleiner als die typische Größe während der fetalen Entwicklung und bei der Geburt, mit dem Umfang von weniger als 2 Standardabweichungen unter dem Mittelwert4. Die kleineren Kopfumfang wird häufig durch eine Vielzahl von Begleiterkrankungen wie Entwicklungsverzögerungen, Ergreifungen, Vision und Hörverlust und Fütterung Schwierigkeiten begleitet.
Jüngste Studien haben Tiermodelle verwendet oder induzierte pluripotente Stammzellen, die Wirkung der ZIKV Infektion auf Neurodevelopment5,6,7,8zu studieren. Während dieser Studien dazu, unser Wissen über ZIKV, die Verwendung von verschiedenen Arten beigetragen haben oder genetisch veränderte Zellen können sehr zeitaufwändig sein und/oder fügen Sie weitere Variablen, die die Wirkung von ZIKV auf verwirren können Zellen Entwicklung von neuronalen5, 6 , 7 , 8. die Schwierigkeit mit der hNSC Kultur, vor allem die nicht-anhaftende Neurosphäre beschrieben in diesem Protokoll ist jedoch, dass die Kultur sehr empfindlich auf die Methoden verwendet, um die Kultur9durchzuführen. Jede Änderung im Medium-Komponenten oder sogar die physische Abwicklung der das Kulturgefäß ist genug, um eine Reaktion von Zellen9zu entlocken. Um diese Probleme anzugehen, haben wir eine in-vitro- menschlichen fetalen Gehirns abgeleitet neuraler Stammzellen (hNSCs) Kultur zu mechanistisch zu befragen, die Wirkung von ZIKV auf fetale neurale Stammzellen entwickelt. Mit unserer Methode, wurden hNSCs für mehr als 80 Passagen ohne offensichtliche phänotypischen Veränderungen10beibehalten. Darüber hinaus wurden die chromosomale Veränderungen wie z. B. Trisomie entweder keine oder nur minimale11. Diese hNSC Kultur wächst als nicht-anhaftende Neurosphäre Kultur. Ein Vorteil von Neurospheres ist, dass die Kugeln eine einzigartige ökologische Nische in Kultur erstellen, die mehr reflektierende der in Vivo Nischen im Vergleich zu zweidimensionalen Kulturen9ist. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist, dass mehrere Zelltypen aus der hNSC Kultur abgeleitet werden können, ermöglichen ein Ermittler zur Beobachtung der Auswirkungen einer bestimmten Variablen auf hNSC überleben und Differenzierung. Dieses Protokoll gilt für Einzelpersonen, die Entwicklung des zentralen Nervensystems oder Dysfunktion mechanistischen Fragen. Das folgende Protokoll beschreibt, wie eine hNSC Kultur um mit ZIKV zu infizieren, und anschließend unterscheiden die hNSCs zur Beobachtung der Auswirkungen einer Infektion auf den Differenzierungsprozess zu erweitern. Es enthält auch Methoden zum Speichern von hNSCs für die langfristige Nutzung und hNSCs in verschiedenen Arten von Neuronen zu unterscheiden, die weitere Untersuchung der ZIKV-induzierten Defizite zur Gehirn Fehlbildung11ermöglichen. Wir glauben, dass dieses Protokoll auch von Interesse für die Ermittler versucht, die Auswirkungen jeder ökologischen Impuls wie Infektionen oder Giftstoffe auf neurale Stammzellen überleben und Differenzierung zu verstehen ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Möglichkeit, Kultur und manipulieren hNSCs stellt ein wichtiges Werkzeug, das für eine Vielzahl von Zwecken von Modellierung menschlichen Krankheit, Drogen Hochdurchsatz-screening-10,11,12,14verwendet werden kann, 15,16,17. Viele Fragen blieben wie wie menschlichen fetalen Gehirns NSC…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde mit Mitteln der John S. Dunn Foundation und das Institut für menschliche Infektion und Immunität von der University of Texas Medical Branch (PW) unterstützt.
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
Riferimenti
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
