Infezione del Virus di Zika delle cellule staminali neurali del cervello fetale umano colto per analisi Immunocytochemical
Summary
Questo articolo descrive in dettaglio i metodi che vengono utilizzati per espandere le cellule staminali neurali del cervello fetale umano nella cultura, come pure come per differenziarli in vari sottotipi neuronali e astrociti, con un’enfasi sull’uso delle cellule staminali neurali per studiare l’infezione del virus di Zika.
Abstract
Cellule staminali neurali del cervello fetale umano sono un sistema di modello unico non geneticamente modificati per studiare l’impatto di vari stimoli sulla neurobiologia inerente allo sviluppo umano. Piuttosto che utilizzare un modello animale o cellule pluripotenti indotte geneticamente modificati, cellule staminali neurali umane forniscono un sistema efficace in vitro per esaminare gli effetti dei trattamenti, farmaci di schermo, o esaminare le differenze individuali. Qui, forniamo i protocolli dettagliati ai metodi utilizzati per espandere le cellule staminali neurali del cervello fetale umano nella cultura con media privo di siero, per differenziarli in vari sottotipi neuronali e astrociti attraverso procedure di innesco differenti e per congelare e recuperare Queste cellule. Inoltre, descriviamo una procedura di utilizzo di cellule staminali neurali del cervello fetale umano per studiare l’infezione del virus di Zika.
Introduction
Virus di Zika (ZIKV) è un flavivirus trasmesso sessualmente, oppure le zanzare zanzara Aedes aegypti e Aedes albopictus di vettori. ZIKV recentemente è stato identificato come una minaccia grave di salute pubblica grazie alla sua facilità di trasmissione e affiliati sintomi neurologici1. Uno dei più riguardo agli effetti neurologici è lo sviluppo di microcefalia nei feti nati da madri infette incinta2,3. La microcefalia è un disordine neurodevelopmental dove la testa è più piccola della dimensione tipica durante lo sviluppo fetale e alla nascita, con la circonferenza inferiore a 2 deviazioni standard sotto la media4. La circonferenza della testa più piccola è comunemente accompagnata da una varietà di comorbidità quali ritardi di sviluppo, convulsioni, visione e perdita dell’udito e difficoltà di alimentazione.
Recenti studi hanno utilizzato modelli animali o indotta da cellule staminali pluripotenti per studiare l’effetto dell’infezione di ZIKV sul neurosviluppo5,6,7,8. Mentre questi studi hanno contribuito alla nostra conoscenza di ZIKV, l’uso di specie diverse o cellule geneticamente modificate potrebbero richiedere molto tempo e/o aggiungere ulteriori variabili che possono confondere l’effetto di ZIKV su lo sviluppo neurale cellule5, 6 , 7 , 8. Tuttavia, la difficoltà di HSNC, in particolare la cultura non aderenti neurosphere descritto in questo protocollo, è che la cultura è molto sensibile ai metodi utilizzati per condurre la cultura9. Qualsiasi cambiamento nelle componenti medi, o anche la gestione fisica della nave cultura, è abbastanza per suscitare una reazione dai cellule9. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato una cultura in vitro umano fetale cervello-derivato delle cellule staminali neurali (hNSCs) per interrogare meccanicistico l’effetto di ZIKV sulle cellule staminali neurali fetali. Utilizzando il nostro metodo, hNSCs sono stati mantenuti per più di 80 passaggi senza apparenti cambiamenti fenotipici10. Inoltre, alterazioni cromosomiche come la trisomia erano entrambi nessuno o minimo11. Questa cultura di HSNC si sviluppa come una cultura neurosphere non aderente. Uno dei vantaggi di neurosfere è che le sfere creano una nicchia ambientale unica nella cultura che è più riflettente di nicchie in vivo rispetto a culture bidimensionale9. Un altro vantaggio di questo protocollo è che più tipi di cellule possono essere derivati dalla cultura HSNC, consentendo un investigatore per osservare l’impatto di una determinata variabile HSNC sopravvivenza e differenziamento. Questo protocollo è applicabile alle persone in cerca di rispondere a meccanicistiche domande riguardanti lo sviluppo del sistema nervoso centrale o disfunzione. Il seguente protocollo descrive come espandere una cultura HSNC per infettare con ZIKV e successivamente differenziare il hNSCs per osservare l’impatto dell’infezione sul processo di differenziazione. Include anche metodi per memorizzare hNSCs per uso a lungo termine e hNSCs si differenziano in vari tipi di neuroni che consentono un ulteriore indagine di deficit indotti da ZIKV contribuendo al cervello malformazione11. Crediamo che questo protocollo è anche di interesse per gli investigatori che cercano di comprendere l’impatto di qualsiasi stimolo ambientale quali l’infezione o tossine sulla sopravvivenza delle cellule staminali neurali e differenziazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di cultura e manipolare hNSCs fornisce uno strumento critico che può essere utilizzato per una varietà di scopi da modellazione malattia umana a10,11,12,14, di screening di stupefacenti a resa elevata 15,16,17. Molte domande rimanevano per essere affrontate come cervello feta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da John S. Dunn Foundation e l’Istituto per le infezioni umane e immunità dell’Università del Texas Medical Branch (P.W.).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
Riferimenti
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
