유 방 우유 Enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 Ex Vivo 모델
Summary
이 프로토콜에서는 쥐에서 우유를 수집 하는 효율적인 방법 뿐만 아니라 신생아 마우스 또는 조 인간의 창 자에서 enteroid 문화 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
인간의 작은 창 자 enteroids는 지하실에서 파생 되 고 줄기 세포 틈새 시장에서 성장 하는 때 모든 상피 세포 유형을 포함. 인간의 enteroid ex vivo 문화 시스템을 설정 하는 기능 모델 장 이상 하 고 특정 세포 응답 관련된 공부에 중요 하다. 최근 몇 년 동안, 쥐와 인간 enteroids 되 고 교양, passaged, 그리고 은행 떨어져 여러 실험실에서 나중에 사용에 대 한 전 세계에 걸쳐. 이 enteroid 플랫폼은 다양 한 치료와 약물의 효과 및 어떤 효과 소장에 다른 세포 유형에가 해지는 테스트를 사용할 수 있습니다. 여기, 신생아 쥐에서 파생 된 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids를 설정 하기 위한 프로토콜 이며 조 인간의 내장 제공 됩니다. 또한,이 enteroid 문화 시스템 종의 유 방 우유의 효과 테스트에 이용 되었다. 마우스 모유 수정된 인간 유 방 펌프를 사용 하 여 효율적으로 얻을 수 있다 고 표현된 마우스 우유 추가 연구 실험을 위해 사용할 수 있습니다. 우리 이제 표현된 마우스, 인간의 효과 입증 하 고 성장 및 enteroids의 확산에 기증자 모유 신생아 쥐 또는 조 인간의 작은 창 자에서 파생 된.
Introduction
Necrotizing enterocolitis (NEC)에 영향을 미치는 거의 1/10 유아 29 주 태동1,2,3전에 태어난 조산에 위장 질환에서 죽음의 주요 원인입니다. 생존은 단지 10-304,5가장 심각한 형태를 NEC 진행과 유아의 반은. 미국에는 약된 2-3 십억 달러/년 소비 하는 NEC6,7, 유아 치료 아직 생존 율도 치료는 지난 30 년 동안 변경 되었습니다. 그러나 NEC의 병 장 부상으로 특징은 점 막 치유8,,910,11,, 신호 경로 악화를 선도 염증 반응 및 메커니즘 염증을 불완전 하 게 이해 남아 있습니다.
인간의 모유의 조산에 대 한 NEC에 대 한 유일한 보호 전략 발견 되었습니다. 우리는 이전 유 방 우유는 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) 신호 통로11를 통해 장 상피에 타고 난 면역 수용 체 통행세 같이 수용 체 4 (TLR4)의 억제를 통해 NEC 개발에 대 한 보호 나타났습니다. 실험 NEC 수식 모유의 보충 감쇠 NEC enterocyte apoptosis의 억제 및 복원 enterocyte 확산 했다 표 피 성장에 의존 하는 방식으로 여로 염증 반응 인자 (EGF) 고 EGFR11. 또 다른 연구에서는 그것은 표시 했다 질 산, 모유의 다른 구성 요소, 분유, 질산염 부족 하 고 NEC에의 증가 주파수에 기여할 수에 비해 장 관류를 변조 하 여 자연 보호에 기여 수식 먹이 유아12,13. 선관위에 대 한 보호에서 포함 되기 위하여 보였다 다른 화합물 모유에 존재 인간의 우유 oligosaccharides, 등 L-아르기닌, 글루타민, lactoferrin14,,1516, 17,,1819. 유 방 우유의 이러한 유익한 요소 NEC의 예방에 있는 그것의 사용의 필요성을 공개 하지만 또한 신호 경로, 및 세포 효과 모유는 선관위에 대 한 보호를 중재 하는 방법에 관련 된 메커니즘의 중요성을 강조 .
진학 하기 위해서는, NEC의 마우스 모델에서 모유의 보호 속성 우리 소설, 사용 하기 쉬운 기술을 개발 모유는 전기 인간 유 방 펌프11,12 사용 하 여 마 취 댐에서 추출 수 있는 마우스에 의해 . 마우스 모유 인수의이 전략이 아니다 유리한, 인간 유 방 펌프 쉽게 사용할 수 있으며 유 방 우유의 조달에 효율적인 뿐만 아니라 종의 유 방 우유 분석을 위해이 방법을 수 있기 때문에 때문에. 결과적으로, 우리 그 표현된 인간의 모유 마우스 유 방 우유의 효과 비교할 수 있습니다 뿐만 아니라 종의 모델에서 우유 은행에서 인간 기증자 우유를 저온 살 균. 이 기술은 NEC 예방으로 그들의 공헌에 관하여 유 방 우유 구성의 연구에 대 한 수 있습니다. 그러나 다른 조사 유 방 우유 추출 방법 개발,, 이러한 기술은 수동는 일반적으로 하나 이상의 연구소 회원20,,2122필요. 여기는 마우스에서 우유를 수집 하는 인간의 전기 유 방 펌프를 수정 하 여 활용할 수 있는 쉬운 기술 제공 됩니다. 이 기술은 또한 다른 종에 적용할 수 있습니다.
가 적절 하 게 신호 경로 NEC와 관련된, 모델 시스템의 질병 과정에 영향을 받을 것으로 알려져 다른 세포 유형 모두 평가 필요 합니다. 여기, 우리가 같은 모델 시스템-enteroids-및 마우스 및 인간의 소장에서 그들의 설립 하나 설명합니다. 인간의 장 enteroids (HIEs)는 혁신, 유전으로 다양 한 비보 전 인간의 모델 위장에서 자리를 차지할 pathophysiological 프로세스의 연구에 도움을 제안 하기 때문에 특히 중요 한 약속를 제공합니다 23. Enteroids 장기 배양 될 발견 되었습니다 나중 사용23, 얼 수 있다 그리고 누구의 문화는 유도할 수 있는 만능 줄기 세포에서 개발 하 고, 인간의 장 Organoids (HIOs), 달리 enteroids 줄기 세포에서 생성 되 고립된 장 지하실24내. Enteroids 유지 일 수 있다25, 신속 하 게 감염 하 고 이후 장 지하실 HIOs23보다 더 분화 된다 쉽게 설정할 수 있습니다. 따라서, HIEs 인간의 위장 상피23의 지역별 구성 및 기능적 속성을 전시 하기 위하여 개발 될 수 있기 때문에 기존 기술을 통해 많은 이점을 제공 합니다. Enteroids 사용 하 여 지역별 제한 및 사용의 용이성에 대 한 준수와 내장의 인간의 모델 필요 때 매우 효과적인 선택입니다. 여기 분리 하 고 기본 줄기 세포 유래 작은 창 자 enteroids 생쥐와 인간의 조산에서 유지 하는 기술을 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
장 상피 직감 장벽 무결성을 유지 하는 병원 체에 대 한 호스트 방어를 제공 하 고 여러 질병의 병 인에 위반 될 수 있는 많은 세포질 하위 구성 됩니다. 동물 모델 질병의 몇 가지 측면을 정리 수 있습니다, 하는 동안 생쥐와 인간의 작은 창 자에서 파생 된 enteroids의 비보 전 모델 다양 한 치료의 효과 테스트 플랫폼을 제공 합니다. Enteroid 모델의 중요성 문화 순진한 또는 병에 걸린 동물과 기…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG은 K08DK101608와 R03DK111473는 건강의 국가 학회 3 월의 천 재단 보조금 No. 5-FY17-79, 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학, 세인트 루이스 아동 병원과의 학과에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 워싱턴 대학 대학원 의학의 세인트 루이스에서 소아과. CJL R01DK104946에 의해 지원 됩니다 (PI: 실버), 어린이 디스커버리 연구소의 워싱턴 대학 및 St. 루이 아동 병원.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
Riferimenti
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