Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di cultura enteroid da mouse neonatale o prematura intestino umano così come un metodo efficace per raccogliere il latte dai topi.
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Articolo metodologico
Latte materno aumenta la crescita di Enteroids: un modello Ex Vivo di proliferazione delle cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
Enteroids intestinale piccolo umano sono derivate dalle cripte e quando coltivate in una nicchia staminale contengono tutti i tipi delle cellule epiteliali. La capacità di stabilire sistemi di coltura ex vivo enteroid umano sono importanti di patofisiologia intestinale di modello e di studiare il particolare risposte cellulari coinvolti. Negli ultimi anni, enteroids da topi e gli esseri umani sono in coltura, secondarie e sopraelevate distanza per un utilizzo futuro in diversi laboratori in tutto il mondo. Questa piattaforma di enteroid può essere utilizzata per testare gli effetti di vari trattamenti e farmaci e quali effetti sono esercitati sui tipi differenti delle cellule nell'intestino. Qui, un protocollo per stabilire primari derivati da cellule staminali piccolo enteroids intestinale derivato dai topi neonatali e prematuro intestino umano è fornito. Inoltre, questo sistema di coltura di enteroid è stato utilizzato per testare gli effetti del latte materno specie-specifici. Latte materno del mouse può essere ottenuto in modo efficiente utilizzando una pompa di seno umano modificate e latte espresso del mouse può essere utilizzato quindi per ulteriori esperimenti di ricerca. Ora dimostriamo gli effetti del mouse espresso, umano, e latte materno donato sulla crescita e sulla proliferazione di enteroids derivati da topi neonatali o intestino tenue umano precoce.
Introduzione
Enterocolite necrotizzante (NEC) è la principale causa di morte per malattie gastrointestinali in bambini prematuri, che interessano quasi 1 in 10 neonati nati prima delle 29 settimane gestazione1,2,3. Metà degli infanti con progresso NEC per la forma più grave, dove la sopravvivenza è solo 10-30%4,5. Negli Stati Uniti, circa 2 miliardi di USD/anno sono spesi nel trattamento di neonati con NEC6,7, eppure terapia né il tasso di sopravvivenza è cambiato nel cors....
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Protocollo
Tutte le procedure di animale in questo studio sono state approvate dall'Università di Washington a St. Louis istituzionale Animal Care e uso Comitato (protocollo 20160187) o uso Comitato (protocollo 14103918) e Università di Pittsburgh istituzionali cura degli animali. Intestino tenue umano fetale a meno di 24 settimane di gestazione è stata ottenuta in conformità degli orientamenti di appalti tessuto anatomico Università di Pittsburgh dopo approvazione Institutional Review Board (protocollo PRO14100537) presso l'Università di Banca di tessuti di Pittsburgh salute Scienze attraverso un sistema onesto mediatore. De-identificati latte umano o latte materno pastorizzato....
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Risultati
Abbiamo innanzitutto cercato di indagare se espresso latte materno o latte materno pastorizzato donatore ha avuto un effetto sul piccolo enteroids intestinale. Infatti, latte materno e latte materno donato ha aumentato la crescita del mouse neonatale (Figura 1A) e prematuro umana derivata enteroids (Figura 1B).
Dal momento che il latte materno ha aumentato la crescita d.......
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Discussione
L'epitelio intestinale è composto di molti sottotipi cellulari che sono responsabili per fornire la difesa ospite contro gli agenti patogeni, mantenendo l'integrità della barriera dell'intestino e possono essere violati nella patogenesi di diverse malattie. Mentre modelli animali possono ricapitolare alcuni aspetti della malattia, il modello ex vivo di enteroids derivato dall'intestino tenue dei topi e gli esseri umani fornisce una piattaforma per testare gli effetti dei vari trattamenti. Il significato del mode.......
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Dichiarazioni
Gli autori hanno nulla da divulgare e senza conflitti di interesse.
Ringraziamenti
MG è sostenuta da sovvenzioni, K08DK101608 e R03DK111473 il National Institutes of Health, marzo Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, i bambini Discovery Institute di Washington University e St. Louis Children Hospital e il dipartimento di Pediatria presso la Washington University School di medicina, St. Louis. CJL è supportato da R01DK104946 (PI: Silverman), ospedale Discovery Institute di Washington University dei bambini e St. Louis Children.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con 4,5 g/L di glucosio e L-glutammina | Lonza | 12-604F | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (insulina) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco ( DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| Amfotericina B | Gibco | 15290-026 | |
| 0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8,0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutammina | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano sulfonato acido (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-acetilcisteina | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Integratore | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Integratore meno vitamina A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inibitore Y-27632, dicloridrato | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Proteina Wnt3a di topo ricombinante | R& D Systems | 1324-WN | |
| Noggin murino | PeproTech | 250-38 | |
| Topo ricombinante R-spondin 1 | R& D Systems | 3474-RS | |
| Fattore di crescita epidermico murino ricombinante (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Fattore di crescita Matrigel Matrice di membrana basale ridotta | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Piastra di Petri per colture cellulari | Eppendorf | 0030700112 | |
| Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti | Eppendorf | 0030722116 | |
| Cella a 48 pozzetti Piastra di coltura | Eppendorf | 0030723112 | |
| Sistema di vetrini a camera Nunc Lab-Tek II a 8 pozzetti | Thermo Scientific | 154534 | |
| Provetta conica da 50 mL | Corning | 352070 | |
| 100 μ M Filtro per cellule sterili | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μ M Filtro per cellule sterili | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldeide (PFA) | Microscopia elettronica Scienze | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Asino normale Siero (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Coperchio del microscopio Vetro | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Microscopio confocale Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G Ago da 1,5 pollici | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurano | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Ossitocina | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Tiralatte elettrico doppio umano | Lansinoh | 044677530163 | |
| Provetta a fondo tondo da 5 ml | Corning | 352058 | |
| tappi in gomma | Frey | Scientific 560761 | |
| Anticorpo Ki67 | Abcam | AB15580 | |
| Umano Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated | DNA Technologies | N/A |
Riferimenti
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts i....
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Ristampe e permessi
