Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire
Summary
Ce protocole décrit comment mettre en place un système de culture enteroid de souris néonatale ou intestin prématurée de l’homme, mais aussi une méthode efficace pour recueillir le lait de souris.
Abstract
Enteroids intestinales petits humains proviennent des cryptes et lorsqu’il est cultivé dans une niche de cellules souches contiennent tous les types de cellules épithéliales. La capacité d’établir des enteroid humaines ex vivo systèmes de culture sont importantes de physiopathologie intestinale de modèle et d’étudier les réponses cellulaires particuliers impliqués. Ces dernières années, enteroids de souris et les humains sont cultivées, repiquées et mis en banque loin pour une utilisation future dans plusieurs laboratoires à travers le monde. Cette plate-forme d’enteroid peut être utilisée pour tester les effets de divers traitements et des médicaments et quels sont les effets sont exercent sur les différents types de cellules dans l’intestin. Ici, un protocole pour l’établissement primaire enteroids intestinale petites cellules souches dérivées provenant de souris néonatales et intestin humain prématuré est fourni. En outre, ce système de culture enteroid a été utilisé pour tester les effets du lait maternel propres à chaque espèce. Lait maternel de la souris peut être obtenu efficacement à l’aide d’un tire-lait humains modifiés et lait exprimé souris peut ensuite être utilisé pour plus amples recherches expérimentales. Nous maintenant de démontrer les effets de souris exprimée, humaine, et lait maternel donneur sur la croissance et la prolifération des enteroids dérivés de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré.
Introduction
L’entérocolite nécrosante (NEC) est la principale cause de décès par maladie gastro-intestinale chez les nouveau-nés prématurés, affectant près de 1 sur 10 enfants nés avant 29 semaines de gestation1,2,3. La moitié des nourrissons avec les progrès de NEC à la forme la plus sévère, où la survie est seulement 10-30 %4,5. Aux États-Unis, environ 2 milliards USD/année sont passées à traiter les enfants avec NEC6,7, mais le taux de survie ni d’une thérapie a changé au cours des 30 dernières années. La pathogenèse de l’entérocolite nécrosante est caractérisée par des lésions intestinales et atteinte muqueuse guérison8,9,10,11, cependant, les voies de signalisation conduisant à un exacerbée la réponse inflammatoire et mécanismes d’inverser l’inflammation restent incomplètement compris.
L’administration de lait maternel s’est avérée pour être la stratégie de protection seulement contre NEC pour les bébés prématurés. Nous avons déjà montré que le lait maternel protège contre NEC développement par le biais de l’inhibition du récepteur toll-like récepteurs immunitaires innées 4 (TLR4) dans l’épithélium intestinal par le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)11de la voie de signalisation. La supplémentation du lait maternel à une formule expérimentale de NEC a atténué la réponse inflammatoire chez NEC, tel que démontré par l’inhibition de l’apoptose de l’entérocyte et restauration des entérocytes prolifération d’une manière qui dépendait de croissance épidermique Factor (EGF) et EGFR11. Dans une autre étude, il a été démontré que des nitrates, une autre composante du lait maternel, contribue à son caractère protecteur en modulant la perfusion intestinale, comparativement aux préparations pour nourrissons, qui manque de nitrate et peuvent contribuer à l’augmentation de la fréquence de l’entérocolite nécrosante dans formule nourris les bébés12,13. Autres composés présents dans le lait maternel qui sont sont révélées être impliquées dans la protection contre le NEC incluent des oligosaccharides de lait humain, L-arginine, glutamine et lactoferrine14,15,16, 17,18,19. Ces éléments bénéfiques du lait maternel révèlent la nécessité de son utilisation dans la prévention de l’entérocolite nécrosante, mais soulignent également l’importance d’étudier les mécanismes de signalisation des voies et les effets cellulaires impliqués dans la façon dont le lait maternel est médiation la protection contre le NEC .
Dans l’ordre afin d’étudier les propriétés protectrices du lait maternel dans un modèle murin de NEC, nous avons développé une technique innovatrice et facile à utiliser, par où la souris le lait maternel peut être extraite d’un barrage anesthésié à l’aide d’un maternel électrique pompe11,12 . Cette stratégie d’acquisition de lait maternel de la souris est avantageuse, non seulement parce que humain tire-laits sont facilement accessibles et efficaces dans l’achat de lait maternel, mais aussi parce que cette méthode permet des analyses de lait maternel propres à chaque espèce. En conséquence, nous permet de comparer les effets du lait maternel de la souris avec celles du lait maternel humain comme donneur humain le lait pasteurisé provenant une banque de lait dans les modèles spécifiques à l’espèce. Cette technique permet l’étude des composants du lait maternel en ce qui concerne leur contribution à la prévention de la NEC. Autres chercheurs ont mis au point des méthodes d’extraction lait maternel, mais ces techniques sont manuelles et nécessitent plus d’un laboratoire membre20,21,22. Une technique simple qui peut être utilisée en modifiant un tire-lait électrique humain pour collecter le lait d’une souris est présentée ici. Cette technique peut également être appliquée à d’autres espèces.
Afin de bien interroger les voies de signalisation impliquées avec NEC, modéliser les systèmes sont nécessaires pour évaluer tous les types de cellules différents connus pour être affectés dans le processus de la maladie. Ici, nous discutons un tel système de modèle – enteroids – et leur mise en place de la souris et de l’intestin humain. Enteroids intestinaux humains (Eih) en particulier fournir des promesses importantes, parce qu’ils offrent un modèle humain novateur, génétiquement diverse le ex vivo pour faciliter l’étude des processus physiopathologiques qui se déroulent dans le tractus gastro-intestinal 23. Enteroids ont été trouvés à être cultivées à long terme et peuvent être congelés pour plus tard utilisation23, et contrairement à l’humain organoïdes intestinale (HIOs), dont les cultures sont développées à partir des cellules souches pluripotentes inductible, enteroids sont générés à partir des cellules souches dans les cryptes intestinales isolées24. Enteroids exigent moins d’entretien, peut être infecté rapidement25et peut être facilement établie puisque des cryptes intestinales sont plus différenciés que HIOs23. Donc, HIEs offrent de nombreux avantages par rapport aux techniques existantes car ils peuvent être développés pour exposer des propriétés de compositions et les fonctions spécifiques à une région de l’ épithélium gastro-intestinal humain23. L’utilisation d’enteroids est un choix très efficace lorsque le besoin d’un modèle humain de l’intestin, avec respect des limites propres à chaque région et facilité d’utilisation. Nous démontrons la technique d’isoler et de maintenir les principales cellules souches dérivées petit intestinale enteroids de souris et les humains prématurés.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’épithélium intestinal est constitué de nombreux sous-types cellulaires qui sont chargé de la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, maintenir l’intégrité de barrière intestinale et peuvent être rompues dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Alors que les modèles animaux peuvent récapituler quelques facettes de la maladie, le modèle ex vivo d’enteroids dérivé de l’intestin des souris et des hommes constitue une plate-forme pour tester les effets de divers traitements. L?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG est pris en charge par des subventions K08DK101608 et R03DK111473 de l’hôpital le National Institutes of Health, mars des Dimes Foundation Grant No 5-FY17-79, l’HME Discovery Institute de Washington University et Saint-Louis pour l’enfance et le service des Pédiatrie à la Washington University School of Medicine, Saint-Louis. CJL est pris en charge par R01DK104946 (PI : Silverman), hôpital Discovery Institute de Washington University des enfants et Saint-Louis pour l’enfance.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
Riferimenti
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