볼륨은 세포의 생리 및 병리학 적 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. Neurites 및 신경 성장에 동적 구조 분석에 필요한 하위 미세 축 분해능으로 생체 외에서 신경 볼륨의 전체 필드 측정을 허용 하는 형광 제외 방법을 설명 합니다.
볼륨은 다른 시간의 척도에 신경 세포의 생리 및 병리학 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. 신경은 그들의 확장된 없는 형태학에 관한 매우 독특한 셀 고 따라서 볼륨 측정에 대 한 여러 방법론 도전을 모집. 신경 성장 체 외에서 의 특별 한 경우 선택한 방법론 하위 미세 축 해상도 전체 필드 관찰 시간 또는 일 분에서 시간의 척도에 함께 포함 되어야 합니다. 셀 모양 재건 confocal 영상, 전기 기반 측정 또는 원자 힘 현미경을 사용 하 여 같은 다른 방법과 달리 최근에 개발 된 형광 제외 방법 (FXm) 이러한 과제를 수행 하기 위해 잠재력이 있다. 그러나, 그것의 원리에서 간단한 되 고, 있지만 신경에 대 한 고해상도 FXm 구현의 여러 조정 및 전용된 방법론 필요 합니다. 선물이 여기 형광 제외, 낮은 거칠기 다중 구획 미세 장치, 그리고 마지막으로 로컬 신경 볼륨의 생체 외에서 측정을 달성 하기 위해 micropatterning의 조합에 따라 하는 방법. 장치에서 제공 하는 높은 해상도 사용 하 여 신경 프로세스 (neurites)의 로컬 볼륨 및 볼륨 성장 콘 (Gc) 같은 신경 성장에 관련 된 몇 가지 특정 구조의 측정 수 있었습니다.
세포질 볼륨의 정확한 지식은 셀 크기 항상성 단 세포 미생물 1 그리고 더 일반적으로 mitotic 세포 2의 문제에 의해 구동 지난 몇 년 동안에서 증가 주목을 받고 있다. 그러나, 셀 볼륨의 질문은 또한 포스트 mitotic 세포는 뉴런 전형적인 예제 구성에 대 한 관련.
볼륨은 참으로 다양 한 스케일과 시간 지점에서 생리 및 병리학 사건의 중요 한 서명 전기 활동 (밀리초 단위) 3 에 돌이킬 수 없는 관련 된 과도 axonal 변형에서 신경 삶에 신경 붓기가 발생 하는 신경 퇴행 성 질병 (인간에서 년간) 4의 무 증상 단계. 그러나, 가장 큰 볼륨의 변화 신경 성장 동안 (고려 유기 체)에 따라 주 또는 일의 중간 시간 규모에서 발생합니다. 뉴런의 확장 하 고 복잡 한 형태는 배수 문제를 제기 셀 크기의 규칙. Axonal 길이 직경 실제로 단단히 규제 vivo에서, 각 신경 유형 5,6값 특정 있습니다.
이러한 문제 vivo에서, 해결 하기 위해 복잡 한 또한 단순화 된 방법으로 해결할 수 있습니다 생체 외에서. 그 목표에 빨리 볼륨 측정 전용 메서드 충분히 성장 역학 (즉 분의 시간 규모에서) 및 호환 관찰 시간 또는 일이 필요 합니다. 여러 가지 방법은 세포 볼륨 시험관에 직접 또는 간접적으로 액세스할 수 년 동안 개발 되었습니다. Confocal 영상에서 셀 재건, 그들 중 하나 이지만이 방법은 약 500 nm 7의 제한 된 축 해상도 표시 하는 동안 빛에 라벨 부착 및 반복 노출 의미. Note 격자 빛 시트 현미경 8라는 더 정교 하 고 최근 방법으로 부분적으로이 두 마지막 단점을 극복할 수 있다는. 원자 힘 현미경 검사 법 사용된 9 되었지만이 검색 방법은 느리고 지루한 본질에 의해. 또한, 육체적 인 접촉을 셀 필요 고려 신경 10의 극단적인 부드러움 측정 방해할 수 있습니다. 다른 세포 유형 11, 하지만 대 한 부적 절 한 확장 뉴런 처럼 접착제 셀 임피던스 또는 공명을 사용 하 여 간접 방법 고용 있다.
가장 유망한 방법 중 하나는 형광 염료로 가득 가까운 챔버에 세포의 제외 된 볼륨의 측정을 기반으로 합니다. 형광 제외 방법 (FXm) 라벨, 필요로 그것의 원리에서 간단 하 고 빠르고, 긴 기간 세포 인구 잠재적으로 하위 광학 축 해상도 광학 이미징 적합 하다. 더 정확 하 게, z에서 해상도 있지만이 궁극적인 해결책을 제한 하는 잡음의 여러 소스 (즉, 세포가 없는 지역에서), 카메라의 동적 범위를 나눈 문화 챔버에 최대 형광 강도에 따라 다릅니다. 이 방법은 매우 강력한 마이그레이션 부착 셀 12 의 볼륨에 따라 또는 철저 하 게 13에 설명 된 대로 포유류 세포의 유사 분열 동안 볼륨 변화 연구 되었습니다. 그러나, 뉴런 FXm 하위 미세 프로세스에 광범위 한 그들의 분파를 고려에 대 한 방법론 문제를 구성 합니다.
선물이 여기 신경 가지와 동적 구조 성장 콘 같은 신경 성장에 관여의 높이와 고정밀 볼륨 액세스를 부드러운 FXm 챔버의 제조를 선도 하는 방법.
실 축 해상도 최적화 하기 위해 측정 하는 개체 보다 비슷한 높이 있어야 합니다. 따라서, 우리는 세 가지 서로 다른 높이의 중앙 측정 챔버 특징 다른 FXm 장치 설계. Neurite 측정에 전념 하는 가장 얇은 (3 µ m 높이):이 낮은 높이 제외 소마는 근처 15 µ m 높은 중간 챔버에 남아. 두꺼운 중앙 챔버 (10과 12 µ m) 전체 세포 성장에 따라 충분히 높다. 장치는 또한 중앙 챔버의 양쪽에 위치한 두 개의 저수지를 포함 한다. 4 개의 주입 구멍 (IH)은 이렇게 구현 하 고 다음과 같이 지정 된다: 입구와 출구 역할 칩, 휴대폰 정지를 반면 다른 두 저수지를 피드.
우리는 알려진된 기하학의 포토 레지스트 구조를 사용 하 여 높이 측정에 대 한 첫 번째 조립된 교정 coverslips가 있다. 우리는 다음 몇 군데 무료 성장 신경, 하지만 또한 형태학 상으로 제한 된 뉴런 접착의 micropatterns에.
뉴런의 볼륨 이미지 구성 때문에이 세포의 길고 얇은 확장 FXm 기술에 대 한 도전. 이 프로토콜 신경 영상 전용 미세 장치의 동일한 종류의 변종을 설명 합니다.
미세 디자인의 측면, 옆에 목표의 형광 제외 이미징에 대 한 기본 이며 절충 한 측면 해상도 이미지 선명도 의미 합니다. 그것은에 게재 되었습니다 13 챔버 높이 보다 작은 초점의 깊이를 선도 높은 NA 없음을 볼륨 측정의 정밀도 대 한 해로운 영상 초점에서 수행한 및 충분 한 마진의 개체의 윤곽선 사이 남아 있는 경우 nterest 그리고 통합의 경계입니다. 그러나, 초점의 깊이 보다 훨씬 더 높은 상공의 사용 때문에 광자 확산는 부드럽게 이미지 선명도 관심사의 목표의 가장자리를 손상 한다. 3 µ m 높은 챔버의 제조 측면 흐리게이 감소 하 고 매우 잘 정의 된 형광 제외 이미지도 높은 NA를 사용 하 여 제공 (0.8) 40 X 목표 측면 고해상도 신경 분 지를 시각화.
3 µ m 높은 챔버의 경우 칩 조립은 중요 한 단계, 특히 하지만 주의 조작 4.1.2에 설명 된 대로 방지 지붕 붕괴. 이러한 얇은 실에 관련 된 볼륨 비율 높은 표면 또한 시간이 지남에 Dextran 농도의 안정성의 문제를 제기. 우리 보육의 1 박 후는 Dextran의 표면 흡수 했다 무시할 수 확인: PBS에서 Dextran을 교체 후 기둥와 배경 사이의 강도 차이 사이 초기 강도 대비 1000 당 약 1 Dextran의 면 전에 서이 두 영역입니다. 참고 아래쪽 coverslip에 및 PDMS 지붕에 신경 준수 수 있습니다. 이 효과 코팅으로 꽃무늬 coverslips (즉, 우리가 하지 PDMS 챔버 내 접착 분자를 품 어 할 때)를 사용 하 여 따라서 엄격 하 게 지역화 챔버의 바닥에 때 사라집니다.
그렇다 하 고 그들의 도전적인 형태 뉴런 FXm 오히려 적합 한 방법, 즉 dextran endocytosis의 주요 한계 중 하나는 매우 제한 된는 사실 때문에이 셀. 우리 선택 10 kDa 정립에에서 억제 범위 (시간) 어떤 보이는 endocytosis 현상.
결론적으로에 FXm의 개념적 단순 일련의 실험적인 문제는 현재 프로토콜, nanometric PDMS 거칠기 및 미세 챔버 높이, 또는 배경 교정의 흘 수에 대 한 수정에 의해 해결 되었습니다에 의해 균형 PDMS 기둥 사이의 천장입니다. 그러나, 형광 매체 제한에 가까운 미세 챔버를 사용 하 여 효과적인 표면 세포 접착, 또는 중앙에서 소마를 제외 하는 필요성을 절감 하 지원 기둥의 필요성 같은 몇 가지 특정 제약 조건 생성 높은 해상도 관측에 액세스할 수 있는 셀의 영역을 제한 하는 높은 선명도와 신경 확장 관찰 하 약 실. 이 방법의 한 가지 가능한 진화 한 광학 교체 물리적 감 금이를 제거 하는 것입니다. 빛 시트 현미경의 새로운 개발 있습니다 결합 될 advantageously FXm 미래에.
The authors have nothing to disclose.
저자는 프로세스 개발 및 장치 제작에 그들의 귀중 한 지원을 위해 하는 ChiLab, 재료 및 마이크로 실험실-Politecnico 디 토리노-교수 C F Pirri, 닥터 M Cocuzza와 박사 S L Marasso의에서 DISAT 인정 하… 우리는 토론 및 이미지 처리에서 지원에 대 한 Quantacell에서 빅터 라신 감사합니다. 우리는 GFP LifeAct 마우스를 제공에 대 한 마우스에 대 한 그들의 지원에 대 한 인 퀴리와 파블로 바 가스와 아나 마리아 레논 (인 퀴리)의 동물 시설에서 이자벨 Grandjean를 마 농 샤 감사. 우리는 형광 배제 방법의 이해에 그들의 도움 인 Langevin 및 Clotilde Cadart, 라 리사 Venkova, Matthieu Piel 인 퀴리-UMR 144에서에서 올리비에 Thouvenin에 감사. 마지막으로, 우리 소에 그들의 지원 위한 인 피에르-질 드 Gennes (CNRS UMS 3750)의 기술 플랫폼을 감사합니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 고급 부여 번호 321107 “첼로,”에 의해 부분적으로 지원 되었다 PSL 대학교 (SwithNeuroTrails 프로젝트), ANR Investissement d’Avenir, IPGG Labex 및 Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |