Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro
Summary
La matriz extracelular cardiaca (ECM) es una compleja red de moléculas que orquestar procesos clave en los tejidos y órganos mientras aguantando remodelación fisiológica durante toda la vida. Descelularización estandarizado del corazón fetal y adulto permite estudios experimentales comparativos de ambos tejidos en un contexto 3D mediante la captura de arquitectura original y propiedades biomecánicas.
Abstract
Conocimiento actual de la matriz extracelular (ECM)-comunicación celular se traduce en estudios grandes bidimensional (2D) cultivo in vitro donde se presentan componentes de ECM como una capa superficial. Estos sistemas de cultivo constituyen una simplificación de la compleja naturaleza de la ECM que abarca la composición bioquímica, estructura y propiedades mecánicas del tejido. Para imitar mejor la comunicación ECM-la célula que forma el microambiente cardiaco, hemos desarrollado un protocolo que permite la descelularización del corazón entero fetal y tejido adulto ventrículo izquierdo explantes simultáneamente para estudios comparativos. El protocolo combina el uso de un tampón hipotónico, un detergente de características de surfactante aniónico y el tratamiento de DNasa sin ningún requisito de conocimientos especializados o equipos. La aplicación de la misma estrategia de descelularización en muestras de tejido de sujetos de edad diferentes es una alternativa para realizar estudios comparativos. El presente Protocolo permite la identificación de diferencias estructurales únicas en adulto y fetales cardiaca ECM malla y biológico respuestas celulares. Además, la presente metodología muestra una aplicación más amplia siendo aplicada con éxito en otros tejidos y especies con ajustes menores, como en las biopsias del intestino humanas y en pulmón de ratón.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) es una red dinámica de moléculas que regulan importantes procesos celulares, es decir, decisión de la suerte, proliferación y diferenciación de1,2. La investigación de las interacciones célula-ECM se ha realizado principalmente en dos dimensiones (2D) en vitro culturas recubierto con componentes de ECM, que constituyen una simplificación de las propiedades nativas de ECM en vivo. Descelularización genera acelular bioscaffolds de ECM como 3D que conservan en gran medida la arquitectura extracelular y composición de los tejidos nativos y órganos3,4. Además de servir como andamios bioactivos para ingeniería de tejidos, biomateriales de ECM 3D decellularized surgen como nuevas plataformas para evaluar biología celular-ECM eso paralelo el ambiente en vivo.
Evaluación de la función diferencial de los componentes de la ECM de distintos tejidos, órganos y edad se beneficiará con el uso de protocolos similares de generar bioscaffolds nativo. En el corazón, hemos desarrollado un protocolo versátil de la descelularización de muestras derivadas de adulto y fetales, como una alternativa para realizar estudios comparativos del microambiente de órgano. Utilizando esta metodología, Capturamos el microambiente cardiaco nativo y demostró que la ECM fetal promueve mayores rendimientos de la repoblación de células cardíacas5. Descelularización dispone identificación de residente diferencias estructurales entre ECM fetal y adultos a nivel de la lámina basal y pericelular arreglo de malla de matriz y fibra composición5. Antes de este trabajo, la comparación directa de los tejidos en las diferentes etapas ontogenic utilizando el mismo enfoque de descelularización se ha divulgado solamente para roedores corazones y riñones de mono rhesus. Además, un número limitado de estudios Informe tejido/órgano fetal descelularización propiamente5,6,7. Esto se ha logrado utilizando SDS como agente único descelularización; sin embargo, diferentes concentraciones de SDS se utilizaron para la descelularización de tejido cardíaco fetal y adulto7,8. SDS es uno de los detergentes iónicos más eficaces para la remoción de material citoplásmico y nuclear y ampliamente utilizado en la descelularización de diferentes tejidos y muestras de9,10. Soluciones que contienen altas concentraciones de SDS y largos períodos de exposición se han correlacionado con la desnaturalización de la proteína, pérdida de glicosaminoglicanos (GAGs) y alteración de las fibrillas de colágeno de10,11y por lo tanto un equilibrio entre preservación y celular la eliminación de ECM es necesario. Para aplicar el mismo procedimiento al tejido del corazón fetal y adulto, el protocolo descrito en este documento se divide en tres pasos secuenciales: lisis de células por choque osmótico (tampón hipotónico); solubilización de lípidos y proteínas, DNA-proteína y proteína-proteína interacciones (0.2% SDS); y remoción de material nuclear (tratamiento de DNasa).
Nuestro protocolo muestra varias ventajas: i) la posibilidad de descelularización equivalente de tejidos cardiacos específicos de la edad mediante la aplicación de la misma estrategia de descelularización; II) no hay requisitos para métodos especializados o equipos; III) listo adaptación a otros tejidos y especies como se ha aplicado con éxito con menores alteraciones en las biopsias del intestino humano12 y ratón pulmonar13; y, sobre todo, iv) puede abordar propiedades biomecánicas ECM permitiendo el montaje de las culturas organotypic de 3D como que más imitan muy de cerca las características moleculares del microambiente del tejido nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La matriz extracelular (ECM) es una red altamente dinámica y compleja de glicoproteínas fibrosas y adhesivas, que consiste en un depósito de numerosos péptidos bioactivos y atrapado los factores de crecimiento. Como importante modulador de la adhesión celular, dinámica del citoesqueleto, movilidad y migración, proliferación, diferenciación y apoptosis, ECM regula activamente el comportamiento y función celular. Sabiendo que el comportamiento celular difiere en 2D y 3D de las culturas, se han hecho esfuerzos par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están en deuda con todos los miembros del laboratorio de Pinto-Ó relevante discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por el Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) en el proyecto “ingeniería CARDIOSTEM los tejidos cardiacos y terapias basadas en células madre para aplicaciones cardiovasculares” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. es un beneficiario de una beca FCT [SFRH/BD/88780/2012] y M.J.O. es miembro de la FCT (FCT-investigador 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
Riferimenti
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