Sammenlignelige Decellularization af føtale og voksne hjerte væv Explants som 3D-lignende platforme til i Vitro undersøgelser
Summary
Den kardiale ekstracellulære matrix (ECM) er et komplekst netværk af molekyler, der orkestrere centrale processer i væv og organer mens enduring fysiologiske remodeling hele livet. Standardiseret decellularization af føtale og voksne hjerter tillader sammenlignende eksperimentelle undersøgelser af både væv i forbindelse med 3D ved at indfange indfødte arkitektur og biomekaniske egenskaber.
Abstract
Nuværende viden af ekstracellulære matrix (ECM)-celle kommunikation kan oversættes til store todimensionale (2D) in vitro kultur studier hvor ECM komponenter er præsenteret som en overfladebehandling. Systemerne kultur udgør en forenkling af den komplekse karakter af væv ECM, der omfatter biokemiske sammensætning, struktur og mekaniske egenskaber. For at bedre emulere ECM-celle kommunikation forme den kardiale mikromiljø, vi udviklede en protokol, der giver mulighed for decellularization af den hele fosterets hjerte og voksen venstre ventrikel væv explants samtidigt for sammenlignende undersøgelser. Protokollen kombinerer brugen af et hypotonic buffer, et rengøringsmiddel af anioniske overfladeaktive egenskaber, og DNase behandling uden krav til specialiserede færdigheder eller udstyr. Anvendelse af den samme decellularization strategi på tværs af vævsprøver fra fag af forskellige alder er en alternativ metode til at udføre sammenlignende undersøgelser. Denne protokol giver mulighed for identifikation af unikke strukturelle forskelle på tværs af føtale og voksne hjerte ECM mesh og biologiske cellulære svar. Desuden, den heri metode viser et bredere program anvendes med succes i andre væv og arter med mindre justeringer, som i human tarmen biopsier og mus lunge.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en dynamisk netværk af molekyler, der regulerer vigtige cellulære processer, nemlig skæbne-beslutning, spredning og differentiering1,2. Undersøgelsen af celle-ECM interaktioner er udført primært i todimensionale (2D) i vitro kulturer belagt med ECM komponenter, der udgør en forenkling af indfødte ECM egenskaber findes i vivo. Decellularization genererer acellulær 3D-lignende ECM bioscaffolds, der i høj grad bevarer den ekstracellulære arkitektur og sammensætningen af indfødte væv og organer3,4. Ud over at fungere som bioaktive stilladser for vævsmanipulering, decellularized 3D ECM biomaterialer fremstår som nye platforme at vurdere celle-ECM biologi at parallel in vivo miljø.
Vurdering af ECM komponenter af forskellige væv, organer og alder differential rolle vil gavne med brug af lignende protokoller at generere indfødte bioscaffolds. I hjertet, har vi udviklet en alsidig protokol for decellularization af føtale og voksne-afledte prøver, som en alternativ tilgang til at udføre sammenlignende undersøgelser af orgel mikromiljø. Du bruger denne metode, vi fanget den indfødte hjerte mikromiljø og viste, at fostrets ECM fremmer højere genindsættelse udbytter af cardiac celler5. Decellularization fastsat yderligere identifikation af hjemmehørende strukturelle forskelle mellem føtale og voksne ECM på niveau med kælder lamina og pericellular matrix mesh arrangement og fiber sammensætning5. Forud for dette arbejde, er head-to-head sammenligning af væv på forskellige ontogenic faser ved hjælp af den samme decellularization tilgang kun blevet rapporteret til rhesus abe nyrer og gnaver hjerter. Derudover rapport et begrænset antal undersøgelser føtalt væv/organ decellularization i sig selv5,6,7. Dette er opnået ved hjælp af SDS som en unik decellularization agent; dog blev særskilt SDS koncentrationer brugt til decellularization af føtale og voksne hjerte væv7,8. SDS er en af de mest effektive Ioniske detergenter for clearance af cytoplasmatisk og nukleart materiale, og udbredt i decellularization af forskellige væv og prøver9,10. Opløsninger indeholdende høje SDS koncentrationer og længere perioder af eksponering er blevet korreleret med protein denaturering, glykosaminoglykan (gag) tab og forstyrrelser af kollagen fibriller10,11, og derfor en balance mellem ECM bevarelse og celle fjernelse er nødvendige. For at anvende samme procedure føtale og voksne hjerte væv, protokollen beskrevet heri er opdelt i tre sekventielle trin: celle lysering af osmotisk chok (hypotonic buffer); oploesning af lipid-proteiner, DNA-protein og protein-protein interaktioner (0,2% SDS); og nukleare materialeaftagning (DNase behandling).
Vores protokollen viser flere fordele: Jeg) muligheden for tilsvarende decellularization af aldersspecifikke hjerte væv ved anvendelse af den samme decellularization strategi; II) ingen krav til specialiserede metoder eller udstyr; III) klar tilpasning til andre væv og arter, som det har været anvendt med succes med mindre ændringer i human tarmen biopsier12 og mus lunge13; og, vigtigst, iv) kan løse ECM biomekaniske egenskaber samtidig med at forsamlingen af 3D-lignende organotypic kulturer, mere nøje efterligne de molekylære funktioner af den oprindelige væv mikromiljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en meget dynamisk og kompleks meshwork af fiber og klæbende glykoproteiner, bestående af et reservoir af mange bioaktive peptider og fanget vækstfaktorer. Som den store modulator celle vedhæftning, cytoskeleton dynamics, motilitet/migration, spredning, differentiering og apoptose regulerer ECM aktivt cellefunktion og adfærd. Vel vidende at cellulære adfærd afviger i 2D og 3D kulturer, har der været bestræbelser på at udvikle nye organotypic modeller, der kan præcist replike…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne står i gæld til alle medlemmer af Pinto–Ó laboratorium for relevante kritisk diskussion. Dette arbejde blev støttet af Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) under projektet “CARDIOSTEM-manipuleret hjerte væv og stem cell-baserede terapier for hjerte-kar-programmer” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. er en modtager af en FCT stipendium [SFRH/BD/88780/2012] og M.J.O. er en FCT fyr (FCT-Investigator 2012).
Materials
| Equipment | |||
| Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
| Fluorimeter | – | – | Equipment available |
| Digital weight scale | – | – | Equipment available |
| Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
| Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
| Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
| Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
| Microtome | – | – | Equipment available |
| Cirurgical Instruments | |||
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
| Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
| Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
| Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
| Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
| Materials | |||
| 24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
| 96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
| Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
| Eppendorff | – | – | Material available |
| 15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
| Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
| Tissue cryopreservation | |||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
| 2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
| Dry ice | – | – | – |
| Decellularization | |||
| NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
| TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
| MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
| DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Histology | |||
| 10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
| Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
| Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
| Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
| Deionized water (DI water) | – | – | – |
| Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
| Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
| Cell culture | |||
| DPBS | VWR | 45000-434 | – |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
| Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
| Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
- Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
- Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
- Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
- Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
- Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
- Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
- Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
- Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).
