Un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome pour définir la Communication médiée par les vésicules extracellulaire entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses
Summary
Injection directe de vésicules extracellulaires dérivées du cancer (EVs) conduit à la reprogrammation de la moelle osseuse supportant la progression tumorale ; Cependant, les cellules médient cet effet n’est pas claire. Ici, les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour étudier les interactions de EV médiée par les cellules souches tumeur mésenchymateuse (MSC) in vivo, révélant un rôle crucial pour MSCs EV-éduqués à la métastase.
Abstract
Dans le microenvironnement tumoral, résidents ou recrutés cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent à la progression maligne dans plusieurs types de cancer. Sous l’influence de signaux environnementaux spécifiques, ces cellules souches adultes peuvent libérer des médiateurs paracrines conduisant à la croissance accélérée tumorale et les métastases. Définir la diaphonie entre la tumeur et MSCs est primordiales pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent la progression du cancer et d’identifier de nouvelles cibles d’intervention thérapeutique.
Les cellules cancéreuses produisent des quantités élevées de vésicules extracellulaires (EVs), qui peuvent affecter profondément le comportement des cellules cibles dans le microenvironnement tumoral ou sur des sites éloignés. EVs tumeur joindre biomolécules fonctionnelle, notamment inflammatoires ARN et des protéines (onco), qui peuvent sensibiliser les cellules stromales afin d’améliorer le comportement métastatique des cellules cancéreuses ou de participer à la formation préalable métastatique niche. Dans cet article, nous décrivons le développement d’un modèle de souris cancer précliniques qui permet l’évaluation précise de la diaphonie EV-négociée entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses. Tout d’abord, nous décrivons la purification et la caractérisation de la tumeur-sécrétée SVE et l’évaluation de l’internalisation de l’EV de MSCs. Nous alors de faire usage d’un multiplex immunodosage axée sur la perle pour évaluer l’altération du profil expression de cytokines MSC induite par le cancer du SVE. Enfin, nous illustrer la génération d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescentes d’ostéosarcome qui récapitule l’interaction de la tumeur-MSC et montrer l’apport des MSCs EV-éduqués à la formation de la croissance et la métastase des tumeurs.
Notre modèle offre la possibilité de définir comment le cancer EVs façonnent un environnement supportant les tumeurs et d’évaluer si le blocus de la EV-mediated communication entre la tumeur et MSCs empêche la progression du cancer.
Introduction
Le microenvironnement tumoral participe activement à la plupart, sinon tous, aspects de la progression de tumorigenèse et cancer du sein, y compris la formation de métastases et le développement de la résistance à la thérapeutique1. Cela souligne la nécessité pour les modèles de souris de cancer orthotopique préclinique permettant la dissection des interactions tumeur-stroma complexes qui se produisent dans le créneau de la tumeur.
Parmi les nombreux composants cellulaires du microenvironnement tumoral, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) contribuent fortement à la progression du cancer dans plusieurs types de cancers comme le cancer du sein, cancer de la prostate, tumeurs cérébrales, myélome multiple et ostéosarcome2 ,3,4,5,6,7. MSCs sont les cellules souches multipotentes qui résident dans divers tissus foetus et adultes, y compris la moelle osseuse, tissu adipeux, placenta, sang de cordon ombilical et autres8,9. En réponse aux signaux inflammatoires généré par le cancer, MSCs migrent vers les sites tumoraux, incorporent dans le microenvironnement tumoral et finalement se différencient en cellules de cancer supportant10. Ces MSCs associés à cancer facteurs essentiels (p. ex., les facteurs de croissance, chimiokines, cytokines et médiateurs immunosuppresseurs) prévoient de la progression tumorale agissant sur les cellules tumorales tant sur stroma environnant2, 3 , 11 , 12 , 13. alors que les effets favorisant la tumeur de MSCs associés au cancer ont été étudiés dans nombreux modèles de cancer, les mécanismes par lesquels les cellules tumorales reprogrammer MSCs pour façonner une niche cancer de promotion sont mal compris. Nous décrivons ici la génération d’un modèle de xénogreffes orthotopiques permettant spécifiquement de l’étude de l’interaction pro-tumorigènes entre cellules cancéreuses osseuse et MSCs, par l’intermédiaire de vésicules extracellulaires (EVs).
SVE est des médiateurs essentiels de communication intercellulaire entre la tumeur et les cellules du stroma14. SVE porte des biomolécules fonctionnelles de la cellule d’origine, y compris les protéines, les lipides et réglementation RNAs. Une fois libérés dans l’espace extracellulaire, ces vésicules peuvent être absorbés par les cellules environnantes ou transportées à des sites distants via le sang ou la circulation lymphatique et peuvent influencer profondément le comportement des cellules cibles. 15 , 16 , 17 par exemple, absorption du cancer EVs par les fibroblastes stromales peut entraîner dans la différenciation des myofibroblastes soutenant l’angiogenèse et en accélérant la tumeur croissance in vivo18,19, internalisation par endothéliale les cellules peuvent stimuler l’angiogenèse tumorale et augmenter la perméabilité vasculaire16,20, et interaction avec les cellules immunitaires pourrait conduire à la suppression du système immunitaire antitumorale21.
Nous avons récemment démontré, à l’aide d’un modèle de souris de xénogreffes orthotopiques bioluminescentes d’ostéosarcome, que les cellules tumorales libèrent des quantités élevées de serveur virtuel Exchange qui invite MSCs pour acquérir un phénotype pro-tumorigènes et métastatiques pro. Cet effet est dû à un changement radical dans le profil d’expression de cytokines MSC (dénommé « Enseignement de la SMC ») et peut être prévenu par l’administration d’un anticorps thérapeutique récepteur de l’interleukine-6 (IL-6R) à7. Nos travaux ont montré que le cancer EVs modulateurs cruciales du comportement MSC, fournissant ainsi une justification pour les approches ciblées microenvironnement stopper la progression de l’ostéosarcome. Ici, les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour étudier la tumeur-MSC EV-mediated interaction in vivo. Ce modèle est destiné à : 1) en particulier définir les altérations du cancer EV du comportement MSC dans le microenvironnement tumoral, 2) évaluer comment cette interaction contribue à la croissance de tumeur osseuse et la formation de métastases et l’étude 3) s’interférant avec la diaphonie induite par l’EV en vivo empêche la progression du cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vésicules extracellulaires sécrétée à la tumeur (EVs) peuvent influer sur la physiologie des cellules mésenchymateuses les et éloignés pour générer un environnement propice à la tumeur. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome qui permet la dissection des interactions entre cellules tumorales induite par l’EV et les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) in vivo. Nous montrons que l’injection systémique de tumeur humaine MSCs EV-éduqués …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.R. Baglio était soutenue par une bourse par l’Associazione Italiana per le la Ricerca sul Cancro (AIRC) co-financé par l’Union européenne. En outre, ce projet a reçu de ne financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne en vertu de la Convention de subvention de Marie Sklodowska-Curie aucun 660200 (S.R. Baglio).
Materials
| Equipment | |||||||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
| Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
| Autoclave | Astell | n.a. | |||||
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
| Culture media | |||||||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
| heparin | LEO | 012866-08 | |||||
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
| Cells | |||||||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
| Disposables | |||||||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
| Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
| Reagents / kits | |||||||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
| BSA | Sigma | A8412 | |||||
| CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
| Mice experiments | |||||||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
| Sutures | Ethicon | V926H | |||||
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) | ||||
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -. H., Chang, M. -. C., Tsai, K. -. S., Hung, M. -. C., Chen, H. -. L., Hung, S. -. C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
