דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal
Summary
הזרקה ישירה של נגזר סרטן שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שמוביל התכנות של מח העצם תמיכה התקדמות הגידול; עם זאת, אילו תאים לתווך את האפקט הזה לא ברור. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לחקור בתיווך EV הגידול-mesenchymal תאי גזע (MSC) אינטראקציות ויוו, חשיפת תפקיד מכריע עבור EV משכילים MSCs ב גרורות.
Abstract
בתוך microenvironment הגידול, תושב או מגויסים בתאי גזע mesenchymal (MSCs) לתרום התקדמות ממאיר של מספר סוגי סרטן. תחת השפעתו של אותות סביבתיים מסוימים, אלה בתאי גזע בוגרים יכולים לשחרר מגשרים paracrine המוביל הגידול המואץ גרורות. הגדרת crosstalk בין הגידול MSCs ישנה חשיבות רבה כדי להבין את המנגנונים שבבסיס התקדמות סרטן ולזהות יעדים הרומן התערבות טיפולית.
תאים סרטניים לייצר כמויות גבוהות של שלפוחית חוץ-תאית (EVs), אשר יכולים להשפיע עמוקות על אופן הפעולה של התאים היעד microenvironment את הגידול או באתרים מרוחקים. הגידול EVs לתחום מולקולות פונקציונלי, לרבות RNAs דלקתיות, חלבונים (onco), אשר יכול לחנך סטרומה תאים כדי לשפר את אופן הפעולה גרורתי של תאי סרטן או להשתתף היווצרות נישה מראש גרורתי. במאמר זה, אנו מתארים את התפתחות סרטן פרה העכבר מודל המאפשר הערכה ספציפית של crosstalk EV בתיווך בין גידול בתאי גזע mesenchymal. ראשית, אנו מתארים לטיהור ודה אפיון של EVs מופרש הגידול והערכה של ההפנמה EV מאת MSCs. לאחר מכן נעשה שימוש מתכלה מבוסס-חרוז מולטיפלקס כדי להעריך את שינוי של הפרופיל ביטוי ציטוקינים MSC המושרה על ידי סרטן EVs. לבסוף, אנו ממחישים את הדור של דגם העכבר xenograft orthotopic ביולומנאסן של אוסטאוסרקומה זה recapitulates את האינטראקציה הגידול-MSC, להראות את התרומה של משכילים EV MSCs היווצרות וצמיחה של גרורות הגידול.
המודל שלנו מספק את ההזדמנות כדי להגדיר איך סרטן EVs לעצב סביבה התומכים בהגידול, וכדי להעריך אם המצור של התקשורת EV בתיווך בין הגידול MSCs מונע התקדמות סרטן.
Introduction
Microenvironment הגידול משתתפת באופן פעיל ביותר, אם לא כל, היבטים של התקדמות tumorigenesis, סרטן, כולל היווצרות גרורות, ההתפתחות של עמידות הרפוי1. זה מדגיש את הצורך orthotopic פרה סרטן בעכבר דגמים המאפשרים ניתוח של אינטראקציות מורכבות הגידול-משתית המתרחשים הנישה הגידול.
בין המרכיבים הסלולר רבים של microenvironment הגידול, גזע mesenchymal (MSCs) בחום לתרום התקדמות סרטן מספר סוגי סרטן כגון סרטן השד, סרטן הערמונית, גידולים במוח, מיאלומה נפוצה, אוסטאוסרקומה2 ,3,4,5,6,7. MSCs הם תאי גזע multipotent השוכנים ברקמות שונות למבוגרים ו עוברית, כולל מח עצם, רקמת שומן, שליה, דם חבל הטבור ועוד8,9. בתגובה אותות דלקתיים שנוצרו על-ידי סרטן, MSCs להעביר לעבר אתרי הגידול, לשלב microenvironment הגידול, להבדיל בסופו של דבר לתוך התאים התומכים בסרטן10. אלה הקשורים לסרטן MSCs מספקים הגורמים החיוניים (קרי, גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים ו מגשרים לדיכוי המערכת החיסונית) התקדמות הגידול פועלים על תאים סרטניים, וגם על שמסביב משתית2, 3 , 11 , 12 , 13. בזמן השפעת קידום גידול סרטן-הקשורים MSCs נחקרו במודלים סרטן רבים, המנגנון שבו תאים סרטניים לתכנת MSCs לעצב גומחה קידום סרטן הם הבינו כהלכה. כאן נתאר את הדור של מודל xenograft orthotopic במיוחד מאפשר הלימוד של אינטראקציה פרו-tumorigenic בין תאים סרטניים עצם MSCs דרך שלפוחית חוץ-תאית (EVs).
EVs הם מתווכים מכריע של המערכת התקשורת בין גידול תאי סטרומה14. EVs לשאת מולקולות פונקציונלי של התא מקור כולל חלבונים, ליפידים ו RNAs רגולטוריות. ברגע שוחרר בחלל חוץ-תאית, שלפוחית אלה שאפשר לקחת על ידי התאים שמסביב או נשא לאתרים מרוחקים דרך הדם או את זרימת הלימפה, יכולים להשפיע עמוקות בהתנהגות התא היעד. 15 , 16 , 17 למשל, ספיגת של סרטן EVs על ידי fibroblasts סטרומה עלולה לגרום בידול myofibroblast להאצת הגידול בצמיחה ויוו18,19, הפנמה מאת אנדותל ותמיכה אנגיוגנזה התאים יכולים לעורר אנגיוגנזה ולהגדיל את חדירות כלי דם16,20, אינטראקציה עם תאים חיסוניים עלול להוביל לדיכוי התגובה החיסונית antitumor21.
אנחנו לאחרונה הפגינו, באמצעות מודל העכבר xenograft orthotopic ביולומנאסן של אוסטאוסרקומה, כי תאים סרטניים לשחרר כמויות גבוהות של EVs הפקודה MSCs כדי לרכוש הפנוטיפ pro-tumorigenic ו- pro-גרורתי. אפקט זה הוא עקב שינוי דרמטי בפרופיל MSC ציטוקין ביטוי (המכונה “MSC education), ניתנת למניעה על ידי הממשל של נוגדן interleukin-6 טיפולי קולטן (IL-6R)7. העבודה שלנו הוכיח כי סרטן EVs הם מאפננים מכריע של התנהגות MSC, ובכך לספק תירוץ עבור גישות ממוקדות microenvironment לעצור את התקדמות אוסטאוסרקומה. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לחקור את הגידול-MSC בתיווך EV אינטראקציה ויוו. מודל זה נועד: 1) במיוחד להגדיר התיקונים EV-induced סרטן של התנהגות MSC microenvironment הגידול, 2) להעריך כמה אינטראקציה זו תורמת הגידול עצם היווצרות גרורות ושל 3) מחקר אם מפריעים ה crosstalk בתיווך EV ויוו מונע התקדמות סרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
מופרש גידול שלפוחית חוץ-תאית (EVs) יכול לשנות את הפיזיולוגיה של מקומי ומרוחק לתאי mesenchymal כדי ליצור סביבה תומכת-הגידול. כאן נתאר את הדור של דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה המאפשר ניתוח של EV בתיווך האינטראקציות בין תאים סרטניים, תאי גזע mesenchymal (MSCs) ויוו. אנו מראים כי הזרקת מערכתית של גידול אנו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ס. ר Baglio נתמכה על ידי התחברות מאת Associazione Italiana לכל סול החיפוש אחר la Cancro (למקורות) שותפה במימון על ידי האיחוד האירופי. בנוסף, הפרויקט הזה קיבל מימון אופק 2020 תכנית של האיחוד האירופי מחקר וחדשנות בהסכם גרנט מארי Sklodowska-קירי לא 660200 (לס. ר Baglio).
Materials
| Equipment | |||||||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
| Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
| Autoclave | Astell | n.a. | |||||
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
| Culture media | |||||||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
| heparin | LEO | 012866-08 | |||||
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
| Cells | |||||||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
| Disposables | |||||||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
| Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
| Reagents / kits | |||||||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
| BSA | Sigma | A8412 | |||||
| CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
| Mice experiments | |||||||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
| Sutures | Ethicon | V926H | |||||
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) | ||||
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -. H., Chang, M. -. C., Tsai, K. -. S., Hung, M. -. C., Chen, H. -. L., Hung, S. -. C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
