ट्यूमर और Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के बीच Extracellular पुटिका-मध्यस्थता संचार को परिभाषित करने के लिए ऑस्टियो के एक नैदानिक माउस मॉडल
Summary
प्रत्यक्ष कैंसर के इंजेक्शन-व्युत्पन्न extracellular बुलबुले (ईवीएस) अस्थि मज्जा के reprogramming ट्यूमर प्रगति का समर्थन करने के लिए सुराग; हालांकि, जो कोशिकाएं इस आशय का मध्यस्थता करती हैं, वह अस्पष्ट है । साथ ही, हम vivo मेंev-मध्यस्थता ट्यूमर-mesenchymal स्टेम सेल (MSC) इंटरैक्शन की जांच करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, मेटास्टेसिस में ev-शिक्षित MSCs के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का खुलासा करते हैं ।
Abstract
ट्यूमर microenvironment के भीतर, निवासी या भर्ती mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) एकाधिक कैंसर के प्रकार में घातक प्रगति में योगदान । विशिष्ट पर्यावरणीय संकेतों के प्रभाव के तहत, ये वयस्क स्टेम सेल paracrine मध्यस्थों को त्वरित ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस के लिए जारी कर सकते हैं । ट्यूमर और MSCs के बीच crosstalk परिभाषित प्राथमिक महत्व का है करने के लिए अंतर्निहित कैंसर प्रगति तंत्र को समझने और उपचारात्मक हस्तक्षेप के लिए उपंयास लक्ष्यों की पहचान ।
कैंसर की कोशिकाओं extracellular बुलबुले की उच्च मात्रा (ईवीएस) का उत्पादन है, जो कि ट्यूमर microenvironment में या दूर के स्थलों पर लक्ष्य कोशिकाओं के व्यवहार को निराधार रूप से प्रभावित कर सकते हैं । ट्यूमर ईवीएस कार्यात्मक, भड़काऊ RNAs और (onco) प्रोटीन सहित अणुओं, कि stromal कोशिकाओं को शिक्षित करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं के मेटास्टेटिक व्यवहार को बढ़ाने या पूर्व मेटास्टेटिक आला गठन में भाग लेने के लिए कर सकते है संलग्न । इस अनुच्छेद में, हम एक नैदानिक कैंसर माउस मॉडल है कि ट्यूमर और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के बीच EV-मध्यस्थता crosstalk के विशिष्ट मूल्यांकन में सक्षम बनाता है के विकास का वर्णन । सबसे पहले, हम ट्यूमर स्रावित ईवीएस और MSCs द्वारा EV internalization के आकलन के शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन । हम तो एक मल्टीप्लेक्स मनका आधारित immunoassay का उपयोग करने के लिए एमएससी cytokine अभिव्यक्ति कैंसर ईवीएस द्वारा प्रेरित प्रोफ़ाइल के परिवर्तन का मूल्यांकन । अंत में, हम ऑस्टियो के एक bioluminescent orthotopic xenograft माउस मॉडल है कि ट्यूमर-एमएससी संपर्क recapitulates की पीढ़ी को वर्णन, और EV के योगदान दिखाने के लिए ट्यूमर विकास और MSCs गठन के लिए मेटास्टेसिस शिक्षित ।
हमारे मॉडल को परिभाषित करने का अवसर प्रदान करता है कैसे कैंसर ईवीएस आकार एक ट्यूमर का समर्थन वातावरण, और मूल्यांकन करने के लिए कि क्या ट्यूमर और MSCs के बीच EV मध्यस्थता संचार की नाकाबंदी कैंसर की प्रगति को रोकता है ।
Introduction
ट्यूमर microenvironment सक्रिय रूप से सबसे अधिक में भाग लेता है, नहीं तो सब, tumorigenesis और कैंसर प्रगति के पहलुओं, मेटास्टेसिस गठन और चिकित्सकीय के लिए प्रतिरोध के विकास सहित1. यह नैदानिक orthotopic कैंसर माउस मॉडल है कि जटिल ट्यूमर के विच्छेदन-स्ट्रोमा ट्यूमर आला में होने वाली बातचीत की अनुमति की जरूरत पर जोर देता है ।
ट्यूमर microenvironment के कई सेलुलर घटकों के अलावा, mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) दृढ़ता से स्तन कैंसर, प्रोस्टेट कैंसर, ब्रेन ट्यूमर, एकाधिक मायलोमा, और ऑस्टियो 2 जैसे कई कैंसर के प्रकार में कैंसर की प्रगति के लिए योगदान ,3,4,5,6,7. MSCs multipotent स्टेम कोशिकाओं है कि अस्थि मज्जा, वसा ऊतक, अपरा, गर्भनाल रक्त, और दूसरों के8,9सहित विभिंन वयस्क और भ्रूण ऊतकों में रहते हैं । कैंसर जनित भड़काऊ संकेतों के जवाब में, MSCs ट्यूमर साइटों की ओर पलायन, ट्यूमर microenvironment में शामिल है और अंत में कैंसर का समर्थन कोशिकाओं को10में अंतर । ये कैंसर से जुड़े MSCs आवश्यक कारक प्रदान (यानी, विकास कारकों, chemokines, साइटोकिंस, और immunosuppressive मध्यस्थों) ट्यूमर प्रगति दोनों ट्यूमर कोशिकाओं पर और आसपास के स्ट्रोमा पर अभिनय के लिए2, 3 , 11 , 12 , 13. जबकि ट्यूमर-कैंसर से संबंधित MSCs के प्रभाव को बढ़ावा देने के कई कैंसर के मॉडल में जांच की गई है, जो तंत्र द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं reprogram MSCs एक कैंसर को बढ़ावा देने आला आकार खराब समझ रहे हैं । यहां हम एक orthotopic xenograft मॉडल है कि विशेष रूप से हड्डी कैंसर कोशिकाओं और extracellular बुलबुले (ईवीएस) के माध्यम से MSCs के बीच समर्थक tumorigenic बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है की पीढ़ी का वर्णन ।
ईवीएस ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के बीच सेलुलर संचार के महत्वपूर्ण मध्यस्थों रहे हैं14. ईवीएस प्रोटीन, लिपिड, और विनियामक RNAs सहित मूल के कोशिका के कार्यात्मक अणुओं कैर्री । एक बार extracellular अंतरिक्ष में जारी, इन बुलबुले आसपास के कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है या रक्त या लसीका परिसंचरण के माध्यम से दूर साइटों के लिए किया जाता है, और कर सकते है की स्थापना लक्ष्य सेल व्यवहार को प्रभावित करते हैं । 15 , 16 , 17 उदाहरण के लिए, stromal fibroblasts द्वारा कैंसर ईवीएस के तेज myofibroblast angiogenesis समर्थन और vivo18,19 मेंट्यूमर के विकास में तेजी का परिणाम हो सकता है internalization द्वारा endothelial कोशिकाओं ट्यूमर angiogenesis को उत्तेजित और नाड़ी पारगम्यता16,20वृद्धि कर सकते हैं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत अर्बुदरोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया21का दमन करने के लिए नेतृत्व हो सकता है.
हम हाल ही में प्रदर्शन किया, ऑस्टियो के एक bioluminescent orthotopic xenograft माउस मॉडल का उपयोग कर, कि ट्यूमर कोशिकाओं ईवीएस के उच्च मात्रा में जारी है कि शीघ्र MSCs एक समर्थक tumorigenic और समर्थक मेटास्टेटिक phenotype प्राप्त करने के लिए । यह प्रभाव एमएससी cytokine अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में एक नाटकीय परिवर्तन के कारण है (“एमएससी शिक्षा” के रूप में संदर्भित), और एक चिकित्सीय interleukin के प्रशासन द्वारा रोका जा सकता है-6 रिसेप्टर (IL-6R) एंटीबॉडी7. हमारे काम का प्रदर्शन किया है कि कैंसर ईवीएस एमएससी व्यवहार के महत्वपूर्ण संग्राहक हैं, इस प्रकार microenvironment के लिए एक तर्क-लक्षित दृष्टिकोण ऑस्टियो प्रगति को रोकने के लिए प्रदान करते हैं । साथ ही, हम vivo मेंEV-मध्यस्थ ट्यूमर-MSC इंटरैक्शन की जांच करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस मॉडल के लिए करना है: 1) विशेष रूप से कैंसर EV-ट्यूमर microenvironment में एमएससी व्यवहार के प्रेरित परिवर्तन को परिभाषित, 2) का मूल्यांकन कैसे इस बातचीत हड्डी ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस गठन के लिए योगदान देता है, और 3) अध्ययन है कि हस्तक्षेप के साथ vivo में EV-मध्यस्थता crosstalk कैंसर की प्रगति को रोकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर स्रावित extracellular बुलबुले (ईवीएस) एक ट्यूमर सहायक वातावरण उत्पन्न करने के लिए स्थानीय और सुदूर mesenchymal कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान को बदल सकते हैं । यहां हम ऑस्टियो के एक नैदानिक माउस मॉडल की पीढ़ी ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सेवाराम Baglio ला Ricerca सुल कांसरो (AIRC) सह यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित के प्रति Associazione Italiana द्वारा एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था, । इसके अलावा इस परियोजना को मैरीन Sklodowska-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट नं ६६०२०० (सेवाराम Baglio को) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान एवं नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है ।
Materials
| Equipment | |||||||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
| Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
| Autoclave | Astell | n.a. | |||||
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
| Culture media | |||||||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
| heparin | LEO | 012866-08 | |||||
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
| Cells | |||||||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
| Disposables | |||||||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
| Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
| Reagents / kits | |||||||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
| BSA | Sigma | A8412 | |||||
| CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
| Mice experiments | |||||||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
| Sutures | Ethicon | V926H | |||||
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) | ||||
Riferimenti
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