Enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet Tumor DNA fra klinisk-patologisk prøvemateriale ved hjælp af Touch aftryk cytologi
Summary
At opnå høj kvalitet genomisk DNA fra tumor væv er et vigtigt første skridt til at analysere genetiske ændringer ved hjælp af næste generation sequencing. I denne artikel præsenterer vi en enkel og hurtig metode til at berige tumorceller og få intakt DNA fra touch aftryk cytologi prøver.
Abstract
Det er afgørende for at bestemme den mutationsmønstre status i kræft før administration og behandling af specifikke molekylære målrettede lægemidler til kræftpatienter. I de kliniske omgivelser, er formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) væv almindeligt brugt til gentest. FFPE DNA er dog generelt beskadiget og fragmenteret under optagelsen processen med formalin. Derfor er FFPE DNA undertiden ikke hensigtsmæssige, gentest på grund af lav kvalitet og kvantitet af DNA. Her vil vi præsentere en metode til touch aftryk cytologi (TIC) at opnå genomisk DNA fra kræftceller, som kan overholdes under et mikroskop. Celle morfologi og kræft celle tal kan evalueres ved hjælp af TIC prøver. Derudover kan udvinding af genomisk DNA fra TIC prøver være afsluttet inden to dage. Det samlede beløb og kvaliteten af TIC DNA opnået med denne metode var højere end i FFPE DNA. Denne hurtige og enkle metode gør det muligt for forskere at opnå høj kvalitet DNA for genetisk testning (fx, næste generation sequencing analyse, digital PCR og kvantitative realtid PCR) og forkorte ekspeditionstid for rapportering af resultater.
Introduction
Næste generation sequencing technology har givet forskere betydelige fremskridt i analyse af genom oplysninger i genetiske variationer, mendelske sygdom, arvelig disposition og kræft 1,2,3 . Kræft genom Atlas (TCGA) og International kræft genom Consortium (ICGC) har forfulgt identifikation af genetiske ændringer i flere typer af almindelige kræftformer4. Hundredvis af væsentlige kræft driver gener er blevet identificeret, og nogle af disse molekyler er at være målrettet til lægemiddel udvikling1,5,6.
I de kliniske omgivelser, er FFPE enheder almindeligt anvendt til patologiske diagnose og molekylære test for forskellige sygdomme, herunder kræft. Men under optagelsen processen med formalin, DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking opstår og DNA fragmentering er induceret. Således er FFPE DNA-prøver ikke altid egnet til genetisk analyse på grund af lav kvalitet og kvantitet af DNA7,8,9. Derudover tager flere dage at forberede FFPE prøver, og tekniske dygtighed er nødvendigt at præcist forberede sektionerne. Derfor er det ønskeligt at udvikle en enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet intakt DNA.
Cytologi er en alternativ metode til patologiske diagnose. Forberedelse af cytologiske prøver er en enklere, mindre dyrt og mere hurtig fremgangsmåde sammenlignet med FFPE forberedelse10. TIC teknik er blevet udført på sentinel lymfeknuder og marginale væv fra brystkræftpatienter for intraoperativ hurtig diagnose for nogle år11,12. Men der er få betænkninger, der har undersøgt, om høj kvalitet genomisk DNA kan udvindes fra TIC prøver og bruges til efterfølgende genetisk analyse. Cytologiske prøver farves almindeligt med Papanicolaou (Pap) eller Giemsa farvning, og vi tidligere rapporteret, at mængden og kvaliteten af DNA ekstraheret fra TIC prøver (især Giemsa-farvede prøver) er overlegen i forhold til prøver fra FFPE væv13. Sammenlignet med Pap farvning, har Giemsa farvning en fordel i at kræve mindre farvning procedurer. I Pap farvning, når prøverne har været fast og farves, skal de være monteret med montering medium (f.eks.Malinol) for at adskille udsnit indhold, såsom tumorceller, normale celler og inflammatoriske celler under et mikroskop. Hvis Pap-modellen er udarbejdet uden montering skridt, er det næsten umuligt at iagttage cellerne under et mikroskop, fordi modellen er tørret. I sammenligning, Giemsa farvning kan observeres i tørret tilstand, montering trin er derfor ikke nødvendigt for hurtig cellulære evaluering. For microdissection er Giemsa farvning mere egnet fordi det kræver tørre prøver.
I denne betænkning, vi indføre en enkel og hurtig metode til forberedelse af TIC prøver med Giemsa farvning og vise, at TIC er en bedre kilde til DNA sammenlignet med FFPE prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse præsenterede vi en alternativ metode til at opnå tumor DNA fra klinisk patologisk prøvemateriale ved hjælp af TIC. TIC forberedelse er meget enkel og kræver mindre tid sammenlignet med FFPE metoder, uden krav om særlige instrumenter10. Alle procedurer fra TIC forberedelse til DNA-ekstraktion kan afsluttes inden for to dage (figur 1). Denne metode forkorter dermed ekspeditionstid for udførelse af gentest. Navnlig, giver dette en betydelig f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle de medicinske og accessoriske ansatte i hospitalet og patienterne for samtykke til at deltage. Vi takker Gabrielle White Wolf, ph.d., fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) til at redigere et udkast af denne betænkning. Denne undersøgelse blev støttet af en licensbetaling for genom forskningsprojekt fra Yamanashi præfektur (YH og M.O.) og et tilskud fra The YASUDA medicinsk Foundation (YH).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
Riferimenti
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
