Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão
Summary
Obtenção de DNA genômico de alta qualidade dos tecidos de tumor é um primeiro passo essencial para a análise de alterações genéticas, utilizando a próxima geração de sequenciamento. Neste artigo, apresentamos um método simples e rápido para enriquecer as células do tumor e obter DNA intacto do toque espécimes de citologia de impressão.
Abstract
É fundamental para determinar o status mutacional no câncer antes de administração e tratamento de drogas de alvo moleculares específicas para pacientes com câncer. Na prática clínica, fixada em formol parafina (FFPE) os tecidos são amplamente utilizados para testes genéticos. No entanto, FFPE DNA geralmente é danificado e fragmentada durante o processo de fixação com formol. Portanto, FFPE DNA não às vezes é adequada para testes genéticos por causa de baixa qualidade e quantidade de DNA. Aqui nós apresentamos um método de citologia de impressão de toque (TIC) para obter o DNA genômico de células de câncer, que pode ser observado sob um microscópio. Número de células de morfologia e câncer de células pode ser avaliado usando amostras TIC. Além disso, a extração de DNA genômico de amostras TIC pode ser concluída dentro de dois dias. O montante total e qualidade de TIC DNA obtido usando esse método foi maior do que a da FFPE DNA. Este método rápido e simples permite que os pesquisadores para obter DNA de qualidade para testes genéticos (por exemplo, análise de sequenciamento na próxima geração, digital PCR e PCR quantitativo em tempo real) e para encurtar o tempo de retorno para relatar os resultados.
Introduction
Próxima geração tecnologia de sequenciamento forneceu pesquisadores avanços significativos na análise da informação do genoma em variações genéticas, doença mendeliana, predisposição hereditária e câncer 1,2,3 . O Atlas de genoma do câncer (TCGA) e International Cancer Genome Consortium (ICGC) têm perseguido a identificação de alterações genéticas em diversos tipos de cancros comuns4. Centenas de genes de condutor essencial do câncer foram identificadas com êxito, e algumas destas moléculas são sendo direcionadas para o desenvolvimento de drogas a1,5,6.
Na prática clínica, espécimes FFPE são comumente usados para diagnóstico patológico e testes moleculares para várias doenças, incluindo câncer. No entanto, durante o processo de fixação com formalina, cross-linking da ADN-proteína ou DNA-DNA ocorre e fragmentação de DNA é induzida. Assim, amostras de DNA FFPE nem sempre são apropriadas para a análise genética por causa da baixa qualidade e quantidade de DNA7,8,9. Além disso, leva vários dias para preparar espécimes FFPE e habilidade técnica é necessária preparar com precisão as seções. Portanto, é desejável desenvolver um método simples e rápido para a obtenção de DNA intacto de alta qualidade.
Citologia é um método alternativo para diagnóstico patológico. Preparação das amostras citológicas é um mais simples, menos cara e mais rápida abordagem comparada com FFPE preparação10. A técnica TIC tem sido realizada em linfonodos sentinela e os tecidos marginais de doentes com cancro da mama para diagnóstico rápido no intra-operatório por alguns anos11,12. No entanto, existem alguns relatórios que têm examinado se o DNA genômico de alta qualidade pode ser extraído amostras TIC e usados para posterior análise genética. Amostras citológicas comumente estão manchadas de Papanicolaou (Pap) ou coloração Giemsa, e informamos anteriormente que a quantidade e a qualidade do DNA extraído de amostras de tique (especialmente amostras manchadas de Giemsa) são superiores para as amostras obtidas da FFPE tecidos13. Em comparação com a coloração de Papanicolau, coloração Giemsa tem uma vantagem em que exigem menos procedimentos de coloração. Na coloração de Papanicolau, depois que as amostras foram fixadas e coradas, eles devem ser montados com montagem médio (por exemplo, Malinol) para distinguir o conteúdo de amostra, tais como as células do tumor, as células normais e células inflamatórias sob um microscópio. Se o espécime de Pap é preparado sem a etapa de montagem, é quase impossível observar as células sob um microscópio, porque a amostra é secada. Em comparação, coloração Giemsa pode ser observado no estado seco, portanto, a etapa de montagem não é necessária para avaliação celular rápida. Por microdissection, coloração Giemsa é mais adequado porque requer espécimes secos.
Neste relatório, apresentamos um método simples e rápido para preparar espécimes TIC com coloração Giemsa e demonstrar que a TIC é uma fonte melhor para DNA, em comparação com espécimes FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, apresentamos um método alternativo para obtenção de tumor DNA de amostras clínicas patológicas, usando TIC. Preparação de TIC é muito simples e precisa de menos tempo em comparação com métodos FFPE, sem a exigência de instrumentos especiais10. Todos os procedimentos de preparação da TIC para extração de DNA podem ser concluídos dentro de dois dias (Figura 1). Esse método, portanto, encurta o tempo de retorno para a realização de teste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todo o pessoal médico e auxiliar do hospital e os pacientes para consentir a participar. Agradecemos a Gabrielle White Wolf, PhD, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste relatório. Este estudo foi suportado por um subsídio para o projeto de pesquisa do genoma da província de Yamanashi (YH e modus operandi) e uma subvenção da Fundação médica de The YASUDA (YH).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
Riferimenti
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
