Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil
Summary
Obtención de ADN genómico de la alta calidad de los tejidos del tumor es un primer paso esencial para el análisis de alteraciones genéticas mediante la siguiente secuencia de generación. En este artículo presentamos un método simple y rápido para enriquecer las células tumorales y obtener ADN intacto del toque de muestras de citología de impresión.
Abstract
Es fundamental para determinar el estado mutacional en cáncer antes de la administración y tratamiento de drogas específicas moleculares específicas para pacientes con cáncer. En el ajuste clínico, tejidos de (FFPE) parafina-encajado formalina-fijos son ampliamente utilizados para las pruebas genéticas. Sin embargo, FFPE ADN generalmente dañado y fragmentado durante el proceso de fijación con formalina. Por lo tanto, FFPE ADN a veces no es adecuado para las pruebas genéticas debido a baja calidad y cantidad de ADN. Aquí presentamos un método de la citología de impresión táctil (TIC) para obtener ADN genómico de las células cancerosas, que puede ser observado bajo el microscopio. Número de células de cáncer y morfología celular puede ser evaluado utilizando a muestras TIC. Además, la extracción de DNA genómico de muestras TIC se puede terminar dentro de dos días. La cantidad total y calidad de ADN TIC obtenidos mediante este método fue mayor que el de ADN FFPE. Este método rápido y simple permite a los investigadores para obtener ADN de calidad para pruebas genéticas (p. ej., análisis de secuenciación de próxima generación, digital PCR y PCR cuantitativo en tiempo real) y para acortar el tiempo de respuesta para informar los resultados.
Introduction
Última generación tecnología de secuenciación ha proporcionado los investigadores avances significativos en el análisis de información del genoma en las variaciones genéticas, enfermedad mendeliana, predisposición hereditaria y cáncer 1,2,3 . El Atlas de genoma del cáncer (TCGA) y el Consorcio Internacional del genoma del cáncer (ICGC) han seguido la identificación de alteraciones genéticas en algunos tipos de cánceres comunes4. Cientos de genes de la conductor de cáncer esenciales han sido correctamente identificados y algunas de estas moléculas se apunta para drogas desarrollo1,5,6.
En el ajuste clínico, muestras FFPE comúnmente se utilizan para diagnosis patológica y moleculares para varias enfermedades, incluyendo cáncer. Sin embargo, durante el proceso de fijación con formalina, ADN-proteína o DNA-DNA Cross-linking ocurre y se induce la fragmentación del ADN. Así, muestras de ADN de FFPE no son siempre adecuadas para análisis genético debido a baja calidad y cantidad de ADN7,8,9. Además, tarda varios días para preparar a las muestras FFPE y habilidad técnica es necesario preparar correctamente las secciones. Por lo tanto, es conveniente desarrollar un método simple y rápido para obtener ADN intacto de alta calidad.
La citología es un método alternativo para el diagnóstico patológico. Preparación de la muestra citológica es un más simple, menos costoso y más rápido acercamiento comparado con FFPE preparación10. La técnica TIC se ha realizado sobre los nodos de linfa del centinela y los tejidos marginales de pacientes de cáncer de mama para el diagnóstico rápido intraoperatorio para algunos años11,12. Sin embargo, hay algunos informes que han examinado si el ADN genómico de alta calidad puede extraerse muestras TIC y utilizado para el posterior análisis genético. Las muestras citológicas son comúnmente teñidas con Papanicolaou (Pap) o tinción de Giemsa, y divulgado previamente que la cantidad y calidad del ADN extraído de muestras TIC (especialmente Giemsa-manchada las muestras) son superiores a las muestras obtenidas de FFPE los tejidos13. En comparación con la tinción de Papanicolau, tinción de Giemsa tiene una ventaja que requieren menos procedimientos de tinción. En la tinción de Pap, después las muestras se han fijado y teñido, debe ser montados con montaje medio (e.g., Malinol) para distinguir el contenido de la muestra, tales como las células tumorales, las células normales y células inflamatorias bajo un microscopio. Si la muestra de Pap está preparada sin el paso de montaje, es casi imposible observar las células bajo un microscopio porque la muestra se seca. En comparación, la coloración de Giemsa se observan en el estado seco, por lo tanto, el paso de montaje no es necesario para la rápida evaluación celular. Para microdisección, tinción de Giemsa es más conveniente porque requiere a especímenes secos.
En este informe, introducir un método simple y rápido para la preparación de especímenes TIC con la tinción de Giemsa y demuestran que el TIC es una mejor fuente de ADN en comparación con especímenes FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se presenta un método alternativo para la obtención de tumor ADN de especímenes patológicos clínicos utilizando TIC. Preparación de TIC es muy simple y necesita menos tiempo en comparación con métodos FFPE, sin la necesidad de instrumentos especiales10. Todos los procedimientos de la preparación de TIC para la extracción de ADN se pueden terminar dentro de dos días (figura 1). Este método por lo tanto acorta el tiempo de respuesta para rea…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todo el personal médico y auxiliar del hospital y los pacientes para consentir a participar. Agradecemos a Gabrielle blanco lobo, PhD, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto de este informe. Este estudio fue apoyado por una subvenciones para proyecto de investigación del genoma de la Prefectura de Yamanashi (Y.H. y M.O.) y una beca de la YASUDA médica Fundación (albergue).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
Riferimenti
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