Att få hög kvalitet genomiskt DNA från tumörvävnad är ett viktigt första steg för att analysera genetiska förändringar med nästa generations sekvensering. I denna artikel presenterar vi en enkel och snabb metod för att berika tumörceller och få intakta DNA från touch avtryck cytologi exemplar.
Det är viktigt att fastställa mutationsstatus i cancer innan administration och behandling av specifika molekylära riktade läkemedel för cancerpatienter. I den kliniska inställningen används formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader allmänt för genetisk testning. FFPE DNA är dock generellt skadad och splittrad under processen fixering med formalin. Därför är FFPE DNA ibland inte tillräckligt för genetisk testning på grund av låg kvalitet och kvantitet av DNA. Här presenterar vi en metod för beröring avtryck cytologi (TIC) erhålla genomiskt DNA från cancerceller, som kan observeras under ett mikroskop. Cell morfologi och cancer cell nummer kan utvärderas med hjälp av TIC exemplar. Dessutom kan utvinning av genomisk DNA från TIC prover slutföras inom två dagar. Den totala mängden och kvaliteten på TIC DNA erhålls med denna metod var högre än för FFPE DNA. Denna snabba och enkla metod tillåter forskare att få hög kvalitet DNA för genetisk testning (t.ex., nästa generations sekvensering analys, digital PCR och kvantitativa realtid PCR) och att förkorta handläggningstiden för rapportering av resultat.
Nästa generation sekvenseringsteknologi har gett forskare betydande framsteg i att analysera genominformationen i genetiska variationer, Mendelian sjukdomar, ärftliga anlag och cancer 1,2,3 . Den Cancer Genome Atlas (TCGA) och International Cancer Genome Consortium (ICGC) har drivit identifiering av genetiska förändringar i flera typer av vanliga cancerformer4. Hundratals viktiga bröstcancergener driver framgångsrikt har identifierats, och några av dessa molekyler är blir måltavla för drogen utveckling1,5,6.
I den kliniska inställningen används FFPE exemplar ofta för patologisk diagnos och molekylär testning för olika sjukdomar, inklusive cancer. Men under processen fixering med formalin DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking uppstår och DNA-fragmentering induceras. Således, FFPE DNA-prover är inte alltid lämpliga för genetisk analys på grund av låg kvalitet och kvantitet av DNA7,8,9. Dessutom tar det flera dagar att förbereda FFPE exemplar och teknisk skicklighet är nödvändigt att noggrant förbereda avsnitten. Därför är det önskvärt att utveckla en enkel och snabb metod för att erhålla hög kvalitet intakt DNA.
Cytologi är en alternativ metod för patologisk diagnos. Cytologiska provberedning är en enklare, mindre dyra, och snabbare metod jämfört med FFPE förberedelse10. TIC tekniken har utförts på sentinel lymfkörtlar och marginella vävnader från bröstcancerpatienter för intraoperativ snabb diagnos för vissa år11,12. Det finns dock några rapporter som har undersökt om hög kvalitet genomiskt DNA kan extraheras från TIC exemplar och används för efterföljande genetisk analys. Cytologiska prover är vanligaste fläckade Papanicolaou (Pap) eller Giemsa färgning och tidigare rapporterade vi att mängden och kvaliteten av DNA extraheras från TIC exemplar (särskilt Giemsa-färgade prover) är överlägsna produktproverna FFPE vävnaderna13. Jämfört med Pap färgning, har Giemsa färgning en fördel i att kräva mindre färgning förfaranden. I Pap färgning, efter proverna har varit fixeras och färgas, måste de vara monterad med montering medium (t.ex., Malinol) för att skilja prov innehållet, till exempel tumörceller, normala celler och inflammatoriska celler i Mikroskop. Om Pap preparatet bereds utan det montering steget, är det nästan omöjligt att iaktta cellerna i Mikroskop eftersom preparatet torkas. I jämförelse, Giemsa färgning kan observeras i torkat tillstånd, därför montering steget är inte nödvändigt för snabb cellulära utvärdering. För lokalt är Giemsa färgning mer lämplig eftersom det kräver torra exemplar.
I detta betänkande, vi införa en enkel och snabb metod för att förbereda TIC exemplar med Giemsa färgning och visar att TIC är en bättre källa för DNA jämfört med FFPE exemplar.
I denna studie presenterade vi en alternativ metod för att erhålla tumör DNA från kliniska patologiska prover med TIC. TIC förberedelserna är mycket enkel och kräver mindre tid jämfört med FFPE metoder, utan krav på särskilda instrument10. Alla procedurer från TIC förberedelse till DNA-extraktion kan slutföras inom två dagar (figur 1). Denna metod förkortar därmed handläggningstid för att utföra genetisk testning. Särskilt, ger detta en betydande …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla den medicinska personalen och servicepersonalen sjukhuset och patienterna för samtycker till att delta. Vi tackar Gabrielle White Wolf, PhD, från Edanz-gruppen (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast till detta betänkande. Denna studie stöddes av ett bidrag för Genome Research Project från Yamanashi prefektur (Y.H. och M.O.) och ett bidrag från The YASUDA medicinska stiftelsen (Y.H.).
FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
Pincette | NATSUME | A-5 | |
1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |