Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais
Summary
Novos protocolos são descritos aqui para isolar e caracterizar micropartículas derivadas de humanos e neutrófilos de rato. Estes protocolos utilizam ultracentrifugação, citometria de fluxo e immunoblotting técnicas para analisar o conteúdo de micropartículas, e eles podem ser usados para estudar o papel das micropartículas derivados de vários tipos de células na função celular.
Abstract
Micropartículas de derivado de neutrófilos polimorfonucleares (PMN)-MPs) são bicapa lipídica, aumentada esféricas com tamanhos que variam de 50 – 1.000 nm de diâmetro. MPs são uma recém evoluindo, parte importante de máquinas de sinalização e comunicação célula a célula. Por causa de seu tamanho e a natureza de sua libertação, até recentemente, existência de MP foi negligenciada. No entanto, com tecnologia melhorada e métodos analíticos a sua função na saúde e na doença está a emergir. Os protocolos aqui apresentados destinam-se a isolar e caracterizar PMN-MPs pelo immunoblotting e citometria de fluxo. Além disso, vários exemplos de implementação são dadas. Esses protocolos para isolamento de MP são rápidos e de baixo custo e não exigem o uso de kits caros. Além disso, eles permitem a rotulagem do MPs após isolamento, bem como pré-marcação de células de origem antes da liberação do MP, usando um corante fluorescente de membrana específicos para visualização e análise por citometria de fluxo. Esses métodos, no entanto, tem várias limitações, incluindo a pureza do PMN e MPs e a necessidade de instrumentação analítica sofisticada. Um citômetro de fluxo high-end é necessário confiável analisar MPs e minimizar falsas positivas leituras devido ao ruído ou autofluorescência. Os protocolos descritos podem ser usados para isolar e definir a biogênese de MP e caracterizam seus marcadores e variação na composição sob diferentes condições de estimulantes. Heterogeneidade de tamanho pode ser explorada para investigar se o conteúdo de partículas de membrana contra exosomes é diferente, e se cumprem papéis diferentes na homeostase do tecido. Finalmente, seguir isolamento e caracterização de MPs, sua função na resposta celular e vários modelos de doença (incluindo, desordens inflamatórias associadas PMN, tais como doenças inflamatórias intestinais ou lesão pulmonar aguda) podem ser explorados.
Introduction
Recentemente, “micropartículas/aumentada” provenientes do citosol celular ou membrana plasmática tornaram-se de grande interesse científico, como dados emergentes sugerem que estas estruturas, que variam de 50-1.000 nm de diâmetro, podem carregar informações biológicas e Servi como um método não-canônicos de comunicação celular. Imunológico derivado de células MPs e particularmente aqueles produzidos por neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são de grande interesse, dado o papel importante de PMN no anfitrião defesa1,2, respostas inflamatórias3e cicatrização de feridas 4. é intrigante, até agora, inúmeros relatos mostraram funções pró-inflamatórias e anti-inflamatórias do PMN-MPs5, sugerindo um potencial contexto-, doença, espécie- e papel de órgão específico de MPs.
Protocolos descritos na presente comunicação fornecem um método econômico, inovadora e adaptável para estudar a função do MPs na saúde e na doença. São aplicáveis a muitos organismos modelo, órgãos e as condições de estimulação. Eles permitem a identificação de vários tipos de MPs e podem ser usados no futuro para abordar suas funções pro-inflamatórias e antiinflamatórias. Como exemplo, descrito aqui é como estudar a função de PMN-MPs em epiteliais ferida cura in vitro e em vivo. O protocolo apresentado para isolamento de rato PMN derivadas da medula óssea foi adaptado com algumas modificações de um método descrito anteriormente6.
Além disso, os protocolos descritos neste estudo permitem para a detecção e caracterização de marcadores específicos que podem ser encontrados na PMN-MPs por dois métodos complementares: Western blot e citometria de fluxo. Encontramos que immunoblotting de MPs usando protocolos padrão5 é fácil e confiável, no entanto, os avanços recentes na sensibilidade dos instrumentos de citometria de fluxo e relação de sinal-para-ruído melhorada agora permitam para posterior análise de MPs usando esse método. Os protocolos descritos neste estudo incorporam avanços recentes e recomendações de artigos originais de pesquisa, incluindo modificações de velocidade de centrifugação e tempo, a adição da amostra de filtragem e congelamento/armazenamento condições7 , 8e como reduzir o “ruído de fundo”, aumentar o limite de detecção do PMN-MPs e discriminar entre diferentes tamanhos de MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocolos para o isolamento e caracterização de MPs PMN-derivados são descritos na presente comunicação. Vários pontos chaves de críticos devem ser tomados em consideração para o sucesso do procedimento. Primeiro, o PMN deve ser isolada fresco e deve ser usado em experimentos com até 2 horas de isolamento para impedir a desgranulação e activação espontânea. Toda manipulação de PMN durante o isolamento e até ao ponto de estimulação deve ser executada no gelo para evitar a activação e prematuro MP ve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos gratos pela assistência técnica do Dr. Suchitra Swaminathan que dirige o núcleo de Northwestern Feinberg escola de medicina Flow Cytometry. Financiamento foi fornecido pela DK101675 (NIH).
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
Riferimenti
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