JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biochimica

Kombinere røntgenkrystallografi med lille vinkel X-Ray spredning til Model ustruktureret regioner af Nsa1 fra S. Cerevisiae

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Denne metode beskriver kloning, udtryk og oprensning af rekombinante Nsa1 for Strukturbestemmelse af røntgenkrystallografi og små-vinkel X-ray spredning (SAXSA), og er gældende for hybrid strukturel analyse af andre proteiner der indeholder begge bestilt og uordnede domæner.

Abstract

Bestemmelse af fuld længde struktur af ribosomet forsamling faktor Nsa1 af Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) er udfordrende på grund af den uorden og protease labile C-terminalen af proteinet. Dette manuskript beskriver metoder til at rense rekombinante Nsa1 fra S. cerevisiae for strukturel analyse af både uorganisk kemi og SAXSA. Røntgenkrystallografi blev udnyttet til at løse strukturen af Nsa1 velordnet N-terminale WD40 domæne, og derefter SAXSA blev brugt til at løse strukturen af C-terminus af Nsa1 i løsning. Løsning spredning data blev indsamlet fra gulv til loft Nsa1 i løsning. Teoretisk spredning amplituder blev beregnet ud fra den høje opløsning krystalstruktur af domænet WD40, og derefter en kombination af stiv krop og ab initio modellering afslørede C-terminus af Nsa1. Gennem denne hybrid tilgang blev hele proteinet kvaternære struktur rekonstrueret. De metoder, der præsenteres her bør gælde generelt for hybrid Strukturbestemmelse af andre proteiner består af en blanding af strukturerede og ustrukturerede domæner.

Introduction

Ribosomes er store ribonucleoprotein maskiner, der udfører vigtige rolle omsætte mRNA til proteiner i alle levende celler. Ribosomes er sammensat af to underenheder, der er produceret i en kompleks proces betegnes ribosomet Biogenese1,2,3,4. Eukaryote ribosomet forsamling bygger på ved hjælp af hundredvis af væsentlige ribosomale forsamling faktorer2,3,5. Nsa1 (Nop7 knyttet 1) er en eukaryote ribosomet forsamling faktor, der specifikt kræves til produktion af store ribosomale subunit6, og er kendt som WD-repeat der indeholder 74 (WDR74) i højere organismer7. WDR74 har vist sig at være nødvendig for blastocyst dannelse i mus8og WDR74 promotor er ofte muteret i kræft celler9. Men funktion og præcise mekanismer af Nsa1/WDR74 i ribosomet forsamling er stadig stort set ukendt. For at begynde at afsløre rollen, som Nsa1/WDR74 i eukaryote ribosomet modning, blev flere strukturelle analyser udført, herunder røntgenkrystallografi og lille vinkel X-ray spredning (SAXSA)10.

Røntgenkrystallografi, Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, Elektron Mikroskopi og SAXSA er alle vigtige teknikker til at studere makromolekylære struktur. Størrelse, form, tilgængelighed og stabilitet af makromolekyler påvirkninger metoden strukturel biologi som en særlig makromolekyle vil være bedst egnet, men kombinerer flere teknikker gennem en såkaldt “hybrid” tilgang er at blive en i stigende grad gavnlig værktøj11. Især er røntgenkrystallografi og SAXSA kraftfulde og komplementære metoder for Strukturbestemmelse af makromolekyler12.

Krystallografi giver høj opløsning atomic strukturer spænder fra små molekyler til store cellulære maskiner såsom ribosomet, og har ført til mange gennembrud i forståelsen af de biologiske funktion af proteiner og andre makromolekyler13. Derudover udnytter struktur-baseret drug design styrken af krystal strukturer til molekylær docking af beregningsmetoder, tilføje en kritisk dimension til narkotikamisbrug opdagelse og udvikling af14. Trods sit brede anvendelighed er fleksibel og uordnede systemer udfordrende at vurdere krystallografi da crystal pakning kan hæmmes eller electron density maps kan være ufuldstændige eller af dårlig kvalitet. Omvendt er SAXSA en løsning-baseret og lav opløsning strukturelle tilgang i stand til at beskrive fleksible systemer spænder fra uordnede sløjfer og termini til uløseligt uordnede proteiner12,15,16. I betragtning af det er kompatibel med en bred vifte af partikel størrelser12, kan SAXSA arbejde synergistisk med krystallografi at udvide viften af biologiske spørgsmål, der kan adresseres af strukturelle undersøgelser.

Nsa1 er egnet til en hybrid strukturelle tilgang, fordi det indeholder et velstruktureret WD40 domæne efterfulgt af en funktionel, men fleksibel C-terminus, som ikke er indstillet til røntgenkrystallografi metoder. Følgende er en protokol til kloning, udtryk og rensning af S. cerevisiae Nsa1 for hybrid Strukturbestemmelse af røntgenkrystallografi og SAXSA. Denne protokol kan tilpasses for at studere strukturerne af andre proteiner, der består af en kombination af bestilte og uordnede regioner.

Protocol

1. rekombinante Protein produktion og rensning af Nsa 1 Nsa1 udtryk Plasmid Design og kloning Få eller købe S. cerevisiae genomisk DNA. PCR forstærke target sekvenser af Nsa1 (Nsa1FL, restkoncentrationer 1-463) og C-terminale afkortet Nsa1 (Nsa1ΔC, restkoncentrationer 1-434) med passende primere ved hjælp af genomisk DNA isoleret fra S. cerevisiae og smeltepunktet af omtrent 60 ° C med en forlængelse tid på 1-2 min. De følgende primere blev bru…

Representative Results

Nsa1 var PCR forstærket fra S. cerevisiae genomisk DNA og subcloned i en vektor, der indeholder en N-terminale 6 x-histidin affinitet tag efterfulgt af MBP og en TEV protease site. Nsa1 blev omdannet til E. coli BL21(DE3) celler og høje udbytter af protein udtryk blev opnået efter induktion med IPTG og vækst ved 25 ° C natten over (figur 1A). Nsa1 var affinitet renset på immobiliserede kobolt affinitet harpiks, efterfulgt af MBP kavale…

Discussion

Ved hjælp af denne protokol, blev rekombinante Nsa1 fra S. cerevisiae genereret for strukturelle undersøgelser af både uorganisk kemi og SAXSA. Nsa1 var velopdragen i løsning og krystalliseret i flere krystal formularer. Under optimering af disse krystaller, blev det opdaget, at C-terminus af Nsa1 var følsomme over for protease nedbrydning. Den høje opløsning, ændres krystalform kunne kun være duplikeres med C-terminale trunkering varianter af Nsa1, sandsynligvis fordi den fleksible C-terminus af Nsa1 f…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diffraktion data blev indsamlet på sydøst regionale samarbejdsprojekter adgang Team (SER-kat) 22-ID og 22-BM beamlines på avanceret Photon kilde (APS), Argonne National Laboratory. SAXSA data blev indsamlet på SIBYLS beamline på forhånd lys kilde (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vi vil gerne takke personalet på SIBYLS beamline for deres hjælp med remote dataindsamling og forarbejdning. Vi er taknemmelige for den nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) masse massespektrometri forskning og støttegruppe for hjælp fastsættelse af protein domæne grænser. Dette arbejde blev støttet af os National Institute for sundhed murene forskningsprogram; Amerikanske National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 til R. E. S.) og de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR, 146626 til M.C.P). Brug af APS blev støttet af os Department of Energy, Office of Science, Office of grundlæggende energi Sciences under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38. Brug af avanceret lys kilde (ALS) blev støttet af direktør, Office of Science, Office af energi Grundvidenskab, af det amerikanske Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Yderligere støtte til SIBYLS SAXSA beamline kommer fra National Institute of Health project MINOS (R01GM105404) og en High-End Instrumentation Grant S10OD018483. Vi vil også gerne takke Andrea Moon og Dr. Sara Andres for deres kritiske læsning af dette manuskript.

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells – focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “parallel” expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

X-ray CrystallographySmall Angle X-ray Scattering (SAXS)Structural AnalysisProtein StructureRecombinant ProteinUnstructured RegionsNsa1S. CerevisiaeHybrid Structural AnalysisProtein FunctionProtein DynamicsProtein AggregationPurificationAffinity ChromatographyGel FiltrationSDS-PAGETEV ProteaseCentrifugal Filtration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image