Trans-inner Cell Mass injektion av embryonala stamceller leder till högre chimärism
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att öka chimera produktionen utan användning av ny utrustning. En enkel orientering förändring av embryot injektionsvätska kan öka antalet embryon produceras, och eventuellt minska tidslinjen till könsceller överföring.
Abstract
I ett försök att öka effektiviteten i skapandet av genetiskt modifierade möss via ES Cell metoder, presenterar vi en anpassning till aktuella blastocysten injektion protokollet. Här rapportera vi att en enkel rotation av embryot, och injektion genom Trans-inre cellmassan (TICM) ökade andelen chimära möss från 31% till 50%, utan extra utrustning eller ytterligare specialiserad utbildning. 26 olika inavlade kloner och 35 totala kloner injicerades under 9 månader. Det var ingen signifikant skillnad i antingen dräktighetsfrekvens eller återvinningsgrad av embryon mellan traditionella injektionsteknik och TICM. Därför, utan någon större förändring i injektionsprocessen och en enkel positionering av blastocysten och injicera genom ICM, släppa de ES-cellerna i hålighet blastocoel kan potentiellt förbättra mängden chimära produktion och efterföljande könsceller överföring.
Introduction
För nästan 25 år varit skapandet av genetiskt målinriktat möss en långsam process, ofta hämmas av en flaskhals i blastocyster ES cellstadie Mikroskop för generering av könsceller överföra chimärer. Senaste framsteg, inklusive CRISPR/Cas91,2 inriktning i ES-celler och hög genomströmning ES cellen generation konsortier som KOMP, har förbättrat generation/tillgängligheten av genetiskt modifierade ES-celler. Generering av könsceller chimärer är dock fortfarande en flaskhals att skapa genmodifierade möss från dessa ES celler3,4. Hög genomströmning ES cell generation projekt har plågats av hög variation i ES cell kvalitet, vilket är avgörande för framgångsrik skapandet av könsceller chimärer. Dessutom är några av de vanligaste utnyttjad ES cell linjerna kända för hög aneuploidi och svåra produktion av könsceller behöriga chimärer5.
Många metoder har utvecklats för att skapa möss med antingen en högre chimär eller helt ES cellen härlett möss6,7,8,9,10. Medan varje system har sina egna meriter, har de också sina brister. Generering av gräsart chimärer, medan generera 100% ES cellen härlett möss, är ineffektiva och i allmänhet begränsade till utkonkurrerat dö ut linjerna 5,6. Nyare metoder för injicering morula kan ge en hög andel chimärer, närmar sig 100%, men kräver i allmänhet betydande extra utrustning (lasrar eller piezos) och utbildning10,11. I laboratorier där dessa tekniker är redan på plats, kan denna nya metod inte vara nödvändigt.
Detta studiens syfte var att hitta en metod som använder vanliga tekniker och lättillgänglig utrustning för att öka graden av chimera generation, ökar risken för könsceller överföring av den muterade allelen att upprätta efterföljande mus kolonin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har länge tänkt att störningar på ICM kan leda till dödlighet, i själva verket nuvarande blastocysten Mikroskop protokoll varnar fortfarande för denna12,13. Vad vi har här visas som Mikroskop genom ICM är inte skadligt för embryot, och ökar avkastningen av chimärer.
Den exakta mekanismen för denna effekt har inte identifierats. Mekaniska störningar av ICM, och den medföljande hypoblast, bör dock öka incidensen av E…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds [delvis] av intramurala forskningsprogrammet i NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Speciellt tack till Shyamal Peddada för statistisk analys. Vi vill också tacka Humphrey Yao, Gary fågelarter och Yuki Arao för granskning av detta manuskript och Franco DeMayo för hans fortsatta stöd och råd.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
Riferimenti
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
