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Chimica

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

Published: December 22, 2017
doi:
10.3791/56956
, , ,
1Department of Chemistry,George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology,George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry,University of Maryland, College Park

Summary

高精度、キャピラリーを用いたマイクロ サンプリングを使用して代謝活動のスナップショットの化学的特性を容易に最小の侵入の個々 のセルの小さな部分の高速の場サンプリングを有効にする手順を述べる。特注の単一セルのキャピラリー電気泳動と質量分析プラットフォームを用いた胚を住んでいます。

Abstract

単一細胞における小分子の定量化は、萌芽期の開発の根底にある基本的なプロセスを理解の新たな可能性を発生させます。異なるセルのサイズは、敏感な選択的、定量的、堅牢で、スケーラブルな特に有効にする単一セル調査で直接ライブ胚、分析の新しいアプローチが必要です。ここでは、自由に南アフリカ爪カエル (アフリカツメガエル)、細胞および進化の生物学の強力なモデルの胚の開発に単一細胞における代謝の場解析を可能にするプロトコルを提案する.このアプローチは、隣接する細胞そのままその後の分析のための胚の単一の識別されたセルからの定義された部分を吸引するキャピラリー マイクロ プローブを使用します。高解像度のタンデム質量分析計を結合マイクロ キャピラリー電気泳動エレクトロ スプレー イオン化 (ESI-CE) インターフェイスによって収集されたセルの内容が分析されます。このアプローチは様々 なセル サイズにスケーラブルな成長の胚の複雑な三次元構造と互換性があります。たとえば、そのマイクロ プローブによる単一細胞 MS-CE により繰り広げられる前駆細胞は胚の開発の間に子孫を生じ、代謝細胞の多様性の解明を紹介します。細胞・発生生物学、以外にもここで説明した単一細胞解析プロトコルは、他のセル サイズ、セル種類、または動物モデルに従う。

Introduction

萌芽期の開発の包括的な理解には、発展途上の生物のすべてのセルに展開するすべての分子変化の特性評価が必要です。単一細胞トランスクリプトーム1開発システム2,3, かなり少ないの深い測定がより小さい分子のスイートについて知られている分子の増幅による次世代シーケンスが可能タンパク質と、特に、代謝産物などを含む単一の胚細胞で生産される (分子量 < 〜 1,500 Da)。組み込みと外因性のイベントに速い動的応答、メタボロームをセルの分子状態の強力な記述子として提供しています。したがって、単一細胞メタボロームは初期胚における細胞多様性の空間的で、一時的な開発を追跡する、機能研究のための新しい分子を識別する可能性を発生させます。しかし、これらの分子の分子増幅せず、メタボロームの検出要求卓越した感度の代謝物質の分析のための選択技術である質量分析法 (MS) を使用します。

単一セルの MS は (参照してくださいレビュー 4,5,6,7,8,9 単一細胞における代謝物の測定に十分な感度と技術のコレクション ,,1011,12,13,14,15)。細胞の再現性の高いサンプリングと代謝産物の効率的な抽出成功した単一細胞における代謝物の検出に不可欠です。アフリカツメガエル胚から細胞を特定の細胞解離は、低分子化合物やペプチド16の特性を可能にしました。他のアプローチは、エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) MS を用いた検出続く個々 の生きているセルのサンプルをマイクロ ピペットを採用しています。たとえば、代謝物は流体力顕微鏡20、その他技術21、間、単一のプローブ19, 圧力プローブ18単一セル ビデオ MS17によって植物や哺乳類細胞で測定しました。 22,23,24。さらに、単一セルの MS ワークフローにイオン化する前に化学分離の定款は効率的にメタボローム、したがって検出前にイオン生成中に潜在的な干渉を軽減することを簡素化します。重要なは、分離はまた分子の同定を支援する化合物に固有の情報を提供します。キャピラリー電気泳動 (CE) は、単一切り裂かれた25,26または microsampled27ニューロン、ニューロン表現型の小分子の違いをキャプチャの代謝物を検出するために使用されています。我々 は最近、ESI タンデムアフリカツメガエル16,28の初期胚から切除した個々 の細胞における代謝物の何百ものトレース レベルの検出を有効にするには、MS に CE を適応しました。これらの研究は驚くべき代謝開発の初期段階に胚細胞の違いを明らかに、不明な発達影響16以前と代謝産物の発見につながった。

ここでは、直接マイクロ プローブによる単一細胞 CE ESI MS29,30を使用して生きている脊椎動物の胚の単一細胞における代謝物の検出を有効にするプロトコルを提供します。選択モデル有機体はセル 32 にまでの制限 8 X. laevis胚のアプローチが開発、その他各種モデル生物の後の段階に適用されるも。このプロトコルは、識別された細胞その場で形態学的に複雑な胚での ~ 10 nL 部分を吸引するのに高解像度イメージング システムによる多軸並進制御の指導の下でのシャープの毛細血管を使用します。このプローブは、小さいセルまで拡張可能、胚における細胞系譜を追跡するために十分な速さである数秒以内に、動作します。極の抽出や極冠小分子、代謝産物など 4 〜 5 で収集したサンプル由来のペプチドの後ハイフン ESI 質量分析計と特注の CE プラットフォームで得られた抽出液の nL を分析 ~ 10 μ L 抽出ソリューション。CE ESI MS プラットフォームの構築と運用は、他の場所で説明されているプロトコルに基づいています。31,32コーアクシャル CE esi は他の場所で説明されているように構築されます。31 4-5 ログ順ダイナミック レンジ (相対28,29,30 で定量化のための機能を備えたトレース レベルの感度を達成するためにコーン ジェット スプレー政権でこのプラットフォームを維持します。または絶対16)。CE ESI MS プラットフォームが 10 のテスト範囲で定量で 8% 相対標準偏差 (RSD) で検出下限 60 amol を提供しています小さな分子の16 X の内因性代謝物の特性を十分である 1 μ M に nM。学細胞。Microprobed 細胞は胚開発30、細胞代謝の時間的、空間的分解解析を可能にするにつれて分裂し続けます。確かに、単一セル MS-CE は代謝の違いの背腹軸16,29、動物植物16、および左右28発達軸だけでなく、セルを占有するセルを検索する使用ことができます。X. laevis30の共通前駆細胞から神経組織運命背側系統を形成します。ここで説明されているプロトコルは、生体分子の広範な配列に適用されることを期待してX. laevis胚30のさまざまな発達段階で個々 の萌芽期細胞の代謝の違いを照会するほか、単一細胞 microsampled 細胞やモデル生物の他の種類と同様に、萌芽期の開発のさまざまな段階から。さらに、分離や生体分子の特性の非常に小さいサンプルと互換性のある別のプラットフォームを使用できますが、特定のため、プローブが使用できます。

Protocol

保守に関連するすべてのプロトコルとアフリカツメガエルの取り扱い機関動物ケアとジョージ ・ ワシントン大学で利用委員会によって承認された (IACUC ないです。A311)。 1. 機器、メディア、溶剤をサンプリングし、料理をサンプリングの準備 次の順序で純水 (~18.2 MΩ.cm 25 ° C で) 次の塩を溶解することによりスタインバーグのソリューション (SS) × 1 を準?…

Representative Results

最近マイクロ プローブによる単一細胞を用いて自由にアフリカツメガエル胚29,30の開発に個々 の特定細胞代謝産物を特徴付ける CE ESI MS。マイクロ プローブにより、高速 (~ 5 sec/セル)、~ 10 の場で吸引個々 のセル、同じセルの複数の願望またはライブ胚 (図 1 b) の同じまたはそれ以降の段?…

Discussion

マイクロ プローブ MS-CE は、ライブ、自由に開発の胚の単一細胞における代謝物の直接評価できます。アプローチの中心に 2 つの技術的なサブコンポーネント、すなわちその場で毛細管特定と高感度 CE ESI さんに比べて細胞解離、毛細管特定高速動作 (5 分対数秒という利点があります。/郭清による細胞)、胚、および開発の後の段階でより小さいセルにスケーラビリティの複雑な三次元…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は (P.N.) に健康補助金 GM114854 の国家機関によってサポートされて、(P.N.) に CA211635、アーノルドとメイベル ベックマン財団ベックマン若い調査官 (P.N.) に付与 (P.N.) にデュポン若い教授賞大量のアメリカの社会分析研究賞 (P.N.) を (R.M.O. および E.P.P.) にコスモス クラブ財団奨学金。意見と結論この書において表明のだけは、著者の資金源の公式見解を必ずしも表さない。

Materials

Reagents for Embryo Culture Media
Potasium chloride Fisher Scientific BP 366-1
Magnesium sulfate Fisher Scientific M 65-3
Calcium nitrate Sigma Aldrich C1396
Cysteine MP Biomedicals 101444
Trizma hydrochloride Sigma Aldrich T3253
Trizma base Sigma Aldrich T1503
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Name Company Catalog Number Comments
Metabolite Extraction Solvents
Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Name Company Catalog Number Comments
Solvents and Standards for CE-ESI-MS
Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A11710X1-AMP
Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
Acetylcholine chloride Acros Organics 159170050
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Fabrication Setup
Micropippette puller Sutter Instrument Co. P-1000
Borosilicate capillaries Sutter Instrument Co. B100-50-10
Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel Fine Science Tools (USA) Inc 11252-30 Corrosion resitant and autoclavable.
Name Company Catalog Number Comments
Microprobe Sampling Setup
Micromanipulator Eppendorf, Hauppauge, NY TransferMan 4r
Stereomicroscope Nikon SMZ18 Should be vibrationally isolated.
Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) Fisher Scientific 13-678-20A
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R
Name Company Catalog Number Comments
CE-ESI-MS Setup
High voltage power supply Spellman CZE1000R The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.
Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
Stereomicroscope Amscope SM-3BZZ Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.
XYZ translation stage Thorlabs PT3
XYZ translation stage Custom-built This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary
Stainless steel sample vials Custom-built
Stainless steel BGE vial Custom-built
Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP040105
Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP075375
Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) Hamilton Co. 21031A For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.
Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL Hamilton Co. 1750TTL
Digital multimeter Fluke Fluke 117
High-resolution Mass Spectrometer Bruker Daltonics Maxis Impact HD High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI
Tunning mixture for mass spectrometer calibration Agilent technologies ESI-L G1969-85000
Data Analysis ver. 4.3 software Bruker Daltonics
Name Company Catalog Number Comments
Ancillary Equipment
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C Labconco 7310022
Analytical microbalance (XSE105DU) Fisher Scientific 01911005
Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1
Freezer (-80 °C) Fisher Scientific 88300ASP
Refrigerated Incubator Fisher Scientific 11475126
Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000
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Keywords: MicroprobeCapillary ElectrophoresisMass SpectrometrySingle-cell MetabolomicsLive FrogXenopus LaevisEmbryosIn Situ MicrosamplingCell BiologyBiologia dello sviluppoMinimally Invasive SamplingAgarose GelPasteur PipetteBorosilicate CapillariesFlaming/Brown Type Capillary PullerDejellyingSteinberg’s SolutionGonadotropinIn Vitro Fertilization
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Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos. J. Vis. Exp. (130), e56956, doi:10.3791/56956 (2017).
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