ميكروبروبي الشعرية التفريد قياس الطيف الكتلي لجميع الخلايا المفردة في أجنة "الضفادع يعيش" (ليفيس النمو)
Summary
ونحن تصف الخطوات التي تمكن بسرعة في الموقع لأخذ العينات من جزء صغير من خلية مفردة بدقة عالية وغزو الحد الأدنى باستخدام المستندة إلى الشعرية الصغرى-أخذ العينات، تيسيرا لتوصيف المواد الكيميائية للقطة نشاط الأيضي في ويعيش الأجنة باستخدام خلية واحدة مبنية خصيصا التفريد الشعرية ومنصة الكتلي.
Abstract
التحديد الكمي للجزيئات الصغيرة في خلايا مفردة يثير إمكانيات جديدة لتحسين فهم العمليات الأساسية التي تقوم عليها التنمية الجنينية. لتمكين خلية واحدة التحقيقات اللازمة مباشرة في الأجنة الحية، نهج تحليلية جديدة، لا سيما تلك التي الحساسة وانتقائية، والكمية، وقوية وقابلة أن خلية مختلفة الأحجام. نقدم هنا، على بروتوكول يتيح تحليل الأيض في الخلايا المفردة في تطوير أجنة الضفدع المخالب جنوب أفريقيا (ليفيس النمو)، نموذج قوية في الخلية وعلم الأحياء التنموي بحرية في الموقع . ويستخدم هذا النهج ميكروبروبي شعرية لنضح جزء محدد من الخلايا المفردة التي تم تحديدها في الجنين، ترك الخلايا المجاورة سليمة للتحليل اللاحق. يتم تحليل محتوى الخلية التي تم جمعها بواسطة microscale شعرية التفريد اليكتروسبراي تاين (CE-ESI) واجهة بالإضافة إلى مطياف كتلة ذات الدقة عالية جنبا إلى جنب. وهذا النهج قابلة لأحجام مختلفة من الخلية ومتوافقة مع بنية ثلاثية الأبعاد معقدة للجنين النامي. وكمثال على ذلك، علينا أن نظهر أن ميكروبروبي خلية واحدة CE-ESI-MS يتيح الكشف عن تغاير خلية الأيض التي تتكشف كما يثير خلية السلف لاحفاد أثناء وضع الجنين. بجانب الخلية وعلم الأحياء التنموي، البروتوكولات تحليل الخلايا المفردة الموصوفة هنا قابلة لأخرى أحجام الخلية، أنواع الخلايا، أو نماذج حيوانية.
Introduction
ويتطلب فهم شامل للتنمية الجنينية توصيف جميع التغيرات الجزيئية التي تتكشف في كل خلية من الكائن الحي النامي. بينما الجيل التالي “التسلسل” مع التضخيم الجزيئية يمكن قياس أعماق من خلية واحدة ترانسكريبتوميس1 في تطوير نظم2،3، أقل بكثير المعروف عن مجموعة الجزيئات الصغيرة تنتج في الخلايا الجنينية واحد، بما في ذلك البروتينات، ولا سيما، والايضات (الكتلة الجزيئية < دا ~ 1,500). مع استجابة سريعة وديناميكية للأحداث الجوهرية والخارجية، ميتابولومي بمثابة واصف قوية للدولة الجزيئية في خلية. ولذلك، يثير ميتابولومي خلية واحدة، يمكن أن تتبع التنمية المكانية والزمانية لتغاير الخلية في الجنين المبكر وتحديد الجزيئات الجديدة للدراسات الفنية. ومع ذلك، دون تضخيم الجزيئية المتاحة لهذه الجزيئات، يطالب الكشف عن ميتابولومي حساسية استثنائية باستخدام الطيف الكتلي (مللي ثانية)، التي هي التكنولوجيا المفضلة لتحليل المستقلب.
خلية واحدة مرض التصلب العصبي المتعدد هو عبارة عن مجموعة من التكنولوجيات بحساسية كافية لقياس نواتج الأيض في الخلايا المفردة (انظر ملاحظات 4،،من56،،من78،9 ،10،11،،من1213،،من1415). أخذ العينات استنساخه من خلايا وكفاءة الاستخراج من نواتج الأيض ضرورية لنجاح الكشف عن نواتج الأيض في الخلايا المفردة. ومكن تشريح كامل الخلية من الخلايا التي تم تحديدها في الأجنة النمو توصيف الجزيئات الصغيرة والببتيدات16. نهوج أخرى تستخدم ميكروبيبيتيس لأخذ عينات الخلايا الحية الفردية تليها الكشف عن استخدام اليكتروسبراي التأين (ESI) مرض التصلب العصبي المتعدد. على سبيل المثال، تم قياس نواتج الأيض في المصنع أو في خلايا الثدييات خلية واحدة فيديو MS17وضغط التحقيق18، مسبار واحد19وقوة فلويديك المجهري20، بين التقنيات الأخرى21، 22،،من2324. بالإضافة إلى ذلك، يبسط إدماج فصل المواد الكيميائية قبل التأين في سير مرض التصلب العصبي المتعدد الخلايا المفردة كفاءة ميتابولومي، وبالتالي التخفيف من حدة التدخلات المحتملة خلال جيل أيون قبل الكشف. الأهم من ذلك، يوفر الفصل أيضا المعلومات الخاصة بمجمع للمساعدة في التعرف الجزيئي. وقد استخدمت التفريد الشعرية (CE) للكشف عن نواتج الأيض في تشريح واحدة25،26 أو ميكروسامبليد27الخلايا العصبية، التقاط جزيء صغير الاختلافات بين الخلايا العصبية تعمل. ونحن مؤخرا تتكيف CE الترادف ESI MS لتمكين تتبع مستوى الكشف عن مئات من نواتج الأيض في الخلايا الفردية التي تم تشريح من الأجنة في وقت مبكر من النمو لإيفيس16،28. هذه الدراسات كشفت عن اختلافات ايضية الدهشة بين الخلايا الجنينية في مرحلة مبكرة من التنمية، وأدت إلى اكتشاف نواتج الأيض مع سبق الآثار الإنمائية غير معروف16.
هنا نقدم بروتوكول تم تمكين الكشف عن نواتج الأيض في الخلايا المفردة في جنينا فقاريات حية باستخدام ميكروبروبي خلية واحدة CE-أي إس أي–مرض التصلب العصبي المتعدد29،30مباشرة. نموذج الكائن المختار هو 8-إلى-32-الخلية X. laevis الجنين، على الرغم من أن هذا النهج ينطبق أيضا على المراحل اللاحقة للتنمية وأنواع أخرى من طراز الكائنات الحية. يستخدم هذا البروتوكول شحذ الشعيرات الدموية مع مراقبة متعدية الجنسيات المتعددة المحاور تحت التوجيه بنظام تصوير عالي الدقة لنضح جزء nL ~ 10 من الخلايا التي تم تحديدها في الموقع في الجنين النامي معقدة شكلياً. هذا ميكروبروبي قابلة لخلايا أصغر ويعمل في غضون ثوان، وسريعة بما فيه الكفاية لتتبع الأنساب الخلية في الجنين. بعد استخراج القطبية أو الجزيئات الصغيرة أبولار، مثل نواتج الأيض والببتيدات، من العينة التي تم جمعها في ~ 4-5 ميليلتر استخراج الحل، 10 ~ يتم تحليل nL استخراج الناتجة في منصة CE مبنية خصيصا بالواصلة إلى مطياف شامل دليل الاستدامة الاقتصادية. بناء وتشغيل النظام الأساسي CE-أي إس أي–مرض التصلب العصبي المتعدد يبني على البروتوكولات المذكورة في أماكن أخرى. 31 , 32 هي التي شيدت في واجهة CE ESI co-المحوري كما هو موضح في مكان آخر. 31 هو الإبقاء على هذا النظام الأساسي في نظام الرش مخروط النفاثة لتحقيق مستوى التتبع حساسية مع قدرة على القياس الكمي على مدى 4-5 ترتيب سجل-دينامية (النسبي28،29،30 أو المطلقة16). يوفر النظام الأساسي CE-أي إس أي–مرض التصلب العصبي المتعدد حد أدنى 60-أمول الكشف مع الانحراف المعياري النسبي بنسبة 8 في المائة (RSD) في كوانتيتيشن أكثر من مجموعة اختبار من 10 نانومتر إلى 1 ميكرومتر للجزيئات الصغيرة16، وكافية لتوصيف نواتج الأيض الذاتية في س. ليفيس الخلايا. خلايا ميكروبروبيد الاستمرار في تقسيم تقدم الجنين من خلال تطوير30، مما يسمح بتحليل حل زمنياً ومكانيا الأيض الخلوية. في الواقع، يمكن استخدامها خلية واحدة CE-أي إس أي-مللي ثانية البحث عن الاختلافات الأيضية بين الخلايا التي تشغل الظهرية البطني16،29،16من الحيوانات النباتية، والمحاور الإنمائية28 من اليسار واليمين، فضلا عن الخلايا أن تشكل نسب الأنسجة العصبية الظهرية الطالع من خلية السلف مشترك في X. laevis30. بالإضافة إلى الاستعلام عن الأيض الاختلافات بين الخلايا الجنينية الفردية في مختلف مراحل نمو الجنين X. laevis 30، ونحن نتوقع أن البروتوكولات المذكورة هنا تنطبق على مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية و ميكروسامبليد خلايا مفردة من مراحل مختلفة من التنمية الجنينية، فضلا عن أنواع أخرى من الخلايا والكائنات نموذج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ميكروبروبي ميكروسامبلينج بينما منصة مختلفة متوافقة مع عينات ضئيلة يمكن أن تستخدم لفصل و/أو توصيف الجزيئات الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميكروبروبي CE-ESI-MS يمكن وصف مباشر من نواتج الأيض في الخلايا المفردة في لايف، بحرية وتطوير الأجنة. في صميم النهج هي المكونات الفرعية التقنية اثنين، هما في الموقع ميكروسامبلينج الشعرية وحساسية عالية CE-ESI-السيدة “بالمقارنة” بتشريح كامل الخلية، ميكروسامبلينج الشعرية في استفادة عملية سريع?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة منح GM114854 (إلى ب. ن.) ومنح CA211635 (إلى ب. ن.) وارنولد بيكمان مابل مؤسسة بيكمان الشباب المحقق (إلى ب. ن.)، جائزة أستاذ الشباب دوبون (إلى ب. ن.)، “الجمعية الأمريكية” للإعلام جائزة بحوث قياس الطيف الكتلي (إلى ب. ن.)، و “مؤسسة نادي” كوزموس زمالة (R.M.O. و E.P.P.). الآراء والاستنتاجات الواردة في هذا المنشور هي فقط تلك التي المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لمصادر التمويل.
Materials
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
Riferimenti
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
- Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
- Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in ‘omics’. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
- Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
- Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
- Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
- Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
- Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
- Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
- Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
- Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
- Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
- Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
- Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
- Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
- Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
- Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V., Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. . Methodologies for Metabolomics. , 119-139 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
- Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
- James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
- Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
- Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
- Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
- Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
- Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
- Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
- Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
- Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1967).
- Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).
