लाइव मेंढक (Xenopus laevis) भ्रूण में एकल कोशिका Metabolomics के लिए Microprobe केशिका ट्रो मास स्पेक्ट्रोमेट्री
Summary
हम कदम है कि सीटू में तेजी से सक्षम करने के लिए उच्च परिशुद्धता और ंयूनतम आक्रमण के साथ एक व्यक्तिगत कोशिका के एक छोटे हिस्से का वर्णन केशिका-आधारित माइक्रो-नमूना, में चयापचय गतिविधि का एक स्नैपशॉट के रासायनिक लक्षण वर्णन की सुविधा के लिए एक कस्टम निर्मित एकल कोशिका केशिका ट्रो और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री मंच का उपयोग कर लाइव भ्रूण ।
Abstract
एकल कोशिकाओं में छोटे अणुओं के ठहराव बेहतर बुनियादी प्रक्रियाओं है कि भ्रूण विकास आबाद को समझने के लिए नई क्षमता उठाती है । जीवित भ्रूण में सीधे एकल सेल जांच को सक्षम करने के लिए, नए विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण की जरूरत है, विशेष रूप से उन है कि संवेदनशील हैं, चयनात्मक, मात्रात्मक, मजबूत, और अलग सेल आकार के लिए स्केलेबल । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक सेल में चयापचय के सीटू विश्लेषण में सक्षम बनाता है के लिए स्वतंत्र रूप से दक्षिण अफ्रीकी पंजा मेंढक (Xenopus laevis), कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली मॉडल के विकास के भ्रूण विकसित करता है । इस दृष्टिकोण एक केशिका microprobe का उपयोग करता है भ्रूण में एकल पहचान कोशिकाओं से एक परिभाषित भाग महाप्राण, पड़ोसी कोशिकाओं बाद विश्लेषण के लिए बरकरार छोड़ रहा है । एकत्र सेल सामग्री एक उच्च संकल्प मिलकर जन स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए युग्मित एक अतिसूक्ष्म केशिका ट्रो electrospray ionization (CE-ईएसआई) इंटरफेस द्वारा विश्लेषण किया जाता है । इस दृष्टिकोण विभिंन कोशिका आकार और जटिल तीन विकासशील भ्रूण के आयामी संरचना के साथ संगत को स्केलेबल है । एक उदाहरण के रूप में, हम प्रदर्शित करते है कि microprobe एकल-कक्ष CE-ईएसआई-MS सक्षम बनाता है elucidation चयापचय कोशिका विविधता कि एक जनक कोशिका के रूप में करेंगी भ्रूण के विकास के दौरान वंश को जन्म देता है । सेल और विकास जीवविज्ञानी के अलावा, एकल सेल विश्लेषण प्रोटोकॉल यहां वर्णित अंय सेल आकार, सेल प्रकार, या पशु मॉडल के लिए उत्तरदाई हैं ।
Introduction
भ्रूण के विकास की एक व्यापक समझ सभी आणविक परिवर्तन है कि विकासशील जीव के हर कोशिका में प्रकट होने के लक्षण वर्णन की आवश्यकता है । जबकि अगले-आणविक प्रवर्धन के साथ पीढ़ी अनुक्रमण प्रणाली2,3, काफी कम छोटे अणुओं के सुइट के बारे में जाना जाता है के विकास में एकल सेल transcriptomes1 के गहरे माप में सक्षम बनाता है प्रोटीन सहित एकल भ्रूण कोशिकाओं में उत्पादित, और, विशेष रूप से, चयापचयों (आणविक जन & #60; ~ १,५०० Da). आंतरिक और बाह्य घटनाओं के लिए एक तेजी से और गतिशील प्रतिक्रिया के साथ, metabolome एक सेल के आणविक राज्य के एक शक्तिशाली डिस्क्रिप्टर के रूप में कार्य करता है । एकल सेल metabolome, इसलिए, जल्दी भ्रूण में सेल विविधता के स्थानिक और लौकिक विकास को ट्रैक करने के लिए और कार्यात्मक अध्ययन के लिए नए अणुओं की पहचान करने की क्षमता को जंम देती है । हालांकि, इन अणुओं के लिए उपलब्ध आणविक प्रवर्धन के बिना, metabolome का पता लगाने असाधारण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), जो metabolite विश्लेषण के लिए पसंद की तकनीक है का उपयोग कर संवेदनशीलता की मांग ।
एकल सेल एमएस एक कोशिकाओं में चयापचयों को मापने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता के साथ प्रौद्योगिकियों का एक संग्रह है (समीक्षा देखें 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15) । कोशिकाओं और चयापचयों के कुशल निष्कर्षण के प्रतिलिपि नमूना एकल कोशिकाओं में चयापचयों का सफल पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । पूरे सेल Xenopus भ्रूण से पहचान की कोशिकाओं के विच्छेदन छोटे अणुओं और पेप्टाइड्स के लक्षण वर्णन16सक्षम है । electrospray ionization (ईएसआई) एमएस का उपयोग करके पता लगाने के बाद व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं नमूना करने के लिए अन्य दृष्टिकोण micropipettes रोजगार. उदाहरण के लिए, चयापचयों संयंत्र या एकल सेल वीडियो MS17, दबाव जांच18, एकल जांच19, और द्रव बल माइक्रोस्कोपी20, अंय तकनीकों के बीच21से स्तनधारी कोशिकाओं में मापा गया, 22,23,24। इसके अतिरिक्त, रासायनिक जुदाई के शामिल होने से पहले एकल सेल एमएस कार्यप्रवाह में ionization करने के लिए कुशलतापूर्वक metabolome को सरल, इस प्रकार आयन पीढ़ी के दौरान संभावित हस्तक्षेप को समाप्त करने से पहले का पता लगाने. महत्वपूर्ण बात, पृथक्करण भी यौगिक विशिष्ट जानकारी के लिए आणविक पहचान में सहायता प्रदान करता है । केशिका ट्रो (CE) एक विच्छेदित25,26 या microsampled27न्यूरॉन्स में चयापचयों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ंयूरॉन phenotypes के बीच छोटे-अणु मतभेदों पर कब्जा । हमने हाल ही में ईएसआई के लिए CE को अनुकूलित करने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि Xenopus laevis16,28के प्रारंभिक भ्रूण से विच्छेदित किया गया में चयापचयों के सैकड़ों के ट्रेस स्तर का पता लगाने में सक्षम एमएस । ये अध्ययन भ्रूण कोशिकाओं के बीच विकास के एक प्रारंभिक चरण में आश्चर्य की बात चयापचय मतभेद का पता चला और पहले से अज्ञात विकास के प्रभावों के साथ चयापचयों की खोज के लिए नेतृत्व किया16.
यहां हम एक प्रोटोकॉल है कि एकल कोशिकाओं में सीधे एक जीवित हड्डीवाला microprobe एकल सेल CE-ईएसआई-MS29,30का उपयोग कर भ्रूण में चयापचयों का पता लगाने सक्षम प्रदान करते हैं । मॉडल जीव चुना 8 से ३२-सेल एक्स laevis भ्रूण है, हालांकि दृष्टिकोण भी विकास और मॉडल जीवों के अंय प्रकार के बाद के चरणों के लिए लागू है । इस प्रोटोकॉल एक उच्च संकल्प इमेजिंग प्रणाली द्वारा मार्गदर्शन के तहत बहु धुरी अनुवाद नियंत्रण के साथ तेज केशिकाओं का उपयोग करता है एक ~ 10 आकृति जटिल विकासशील भ्रूण में सीटू में कोशिकाओं के nL भाग महाप्राण । इस microprobe छोटे कोशिकाओं को स्केलेबल है और सेकंड के भीतर चल रही है, जो पर्याप्त तेजी से भ्रूण में सेल वंश ट्रैक है । ऐसे चयापचयों और पेप्टाइड्स के रूप में ध्रुवीय या apolar छोटे अणुओं, निकालने के बाद में एकत्र नमूना से ~ 4-5 µ l निष्कर्षण समाधान, एक ~ 10 nL के परिणामस्वरूप निकालने के एक कस्टम में विश्लेषण किया है CE मंच एक ईएसआई जन स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए बंटे । निर्माण और CE-ईएसआई-एमएस मंच के संचालन कहीं और वर्णित प्रोटोकॉल पर बनाता है । 31 , ३२ सह के सलए CE-ईएसआई इंटरफेस का निर्माण किया है के रूप में कहीं और वर्णित है । 31 इस मंच शंकु-जेट छिड़काव शासन में एक 4-5 लॉग-आदेश गतिशील रेंज पर ठहराव के लिए एक क्षमता के साथ ट्रेस स्तर संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए बनाए रखा है (सापेक्ष28,29,30 या निरपेक्ष16) । CE-ईएसआई-MS प्लेटफार्म एक ६०-अमोल के साथ पता लगाने की कम सीमा प्रदान करता है 8% सापेक्ष मानक विचलन (RSD) quantitation में 10 एनएम के लिए 1 µ m करने के लिए छोटे अणुओं16, जो एक्स में अंतर्जात चयापचयों की विशेषता के लिए पर्याप्त हैं . laevis कक्ष । Microprobed कोशिकाओं को भ्रूण के रूप में भाग30विकास के माध्यम से प्रगति जारी है, अस्थाई और स्थानिक सेलुलर चयापचय के विश्लेषण के लिए अनुमति दी । दरअसल, एकल-कक्ष CE-ईएसआई-MS कोशिकाओं है कि पृष्ठीय पर कब्जा के बीच चयापचय मतभेदों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-ventral16,29, पशु-वनस्पति16, और वाम अधिकार28 विकासात्मक कुल्हाड़ियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं कि तंत्रिका ऊतक फार्म एक्स laevis30में एक आम जनक सेल से पृष्ठीय वंश दुर्भाग्यशाली । X. laevis भ्रूण के विभिंन विकास चरणों में व्यक्तिगत भ्रूण कोशिकाओं के बीच चयापचय मतभेदों को क्वेरी के अलावा30, हम पूर्वानुमान है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल और अणुओं की एक व्यापक सरणी के लिए लागू कर रहे है एकल कोशिकाओं भ्रूण विकास के विभिंन चरणों के साथ ही कोशिकाओं और मॉडल जीवों के अंय प्रकार से microsampled । इसके अतिरिक्त, microprobe microsampling के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जबकि miniscule नमूनों के साथ संगत एक अलग मंच जुदाई और/या के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Microprobe CE-ईएसआई-एमएस रहते हैं, स्वतंत्र रूप से भ्रूण के विकास में एकल कोशिकाओं में चयापचयों के प्रत्यक्ष लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है । दृष्टिकोण के दिल में दो तकनीकी उपघटक हैं, अर्थात् में सीटू केशिका microsa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य अनुदान GM114854 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (करने के लिए पीएनएस) और CA211635 (पीएनएस करने के लिए), अर्नोल्ड और माबेल Beckman फाउंडेशन Beckman युवा अन्वेषक अनुदान (पीएनएस करने के लिए), ड्यूपॉंट युवा प्रोफेसर पुरस्कार के लिए (पीएनएस), अमेरिकन सोसायटी फॉर मास स्पेक्ट्रोमेट्री अनुसंधान पुरस्कार (to पीएनएस), और ब्रह्मांड क्लब फाउंडेशन फैलोशिप (R.M.O. और E.P.P. के लिए) । राय और इस प्रकाशन में व्यक्त निष्कर्ष केवल लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि धन स्रोतों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
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