Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)
Summary
Descriviamo i passaggi che permettono il campionamento veloce in situ di una piccola parte di una singola cella con alta precisione e l’invasione minima utilizzando micro-campionamento basato sul capillare, per facilitare la caratterizzazione chimica di uno snapshot di attività metabolica in vivere gli embrioni utilizzando una piattaforma di spettrometria di massa e di elettroforesi capillare su misura singola cella.
Abstract
La quantificazione di piccole molecole in singole cellule genera nuove potenzialità per comprendere meglio i processi di base che sottendono lo sviluppo embrionale. Per abilitare unicellulare indagini direttamente in embrioni dal vivo, nuovi approcci analitici sono necessari, specialmente quelli che sono sensibile, selettiva, quantitativa, robusta e scalabile per celle di diverse dimensioni. Qui, presentiamo un protocollo che consente l’analisi in situ di metabolismo in singole cellule liberamente lo sviluppo di embrioni di Rana artigliata dell’africano del Sud (Xenopus laevis), un potente modello in biologia cellulare e dello sviluppo. Questo approccio utilizza una microsonda capillare per aspirare una porzione definita da singole cellule identificate nell’embrione, lasciando le cellule vicine intatto per la successiva analisi. Il contenuto della cella raccolti è analizzato da un interfaccia su microscala elettroforesi capillare electrospray ionizzazione (CE-ESI) accoppiato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione tandem. Questo approccio è scalabile a vari formati di cella e compatibile con la struttura tridimensionale complessa dell’embrione in via di sviluppo. Ad esempio, dimostriamo che microsonda che unicellulare CE-ESI-MS consente la delucidazione di eterogeneità metabolica delle cellule che si dispiega come una cellula del progenitor dà luogo a discendenti durante lo sviluppo dell’embrione. Oltre a cellulare e biologia dello sviluppo, i protocolli di analisi unicellulare descritti qui sono suscettibili di altre celle di dimensioni, tipi cellulari o modelli animali.
Introduction
Una comprensione globale dello sviluppo embrionale richiede la caratterizzazione di tutti i cambiamenti molecolari che si dipanano in ogni cellula dell’organismo in via di sviluppo. Mentre la Next-Generation Sequencing con amplificazione molecolare permette profonda misura di singola cellula trascrittomi1 in sviluppo sistemi2,3, considerevolmente di meno è conosciuto circa la suite di molecole più piccole prodotta in singole cellule embrionali, tra cui proteine e, soprattutto, metaboliti (massa molecolare < Da ~ 1.500). Con una risposta veloce e dinamica agli eventi intrinseci ed estrinseci, il metaboloma serve come un potente descrittore dello stato molecolare di una cella. Il metaboloma unicellulare, pertanto, aumenta il potenziale di seguire l’evoluzione spaziale e temporale delle eterogeneità cellulare nell’embrione precoce e di identificare nuove molecole per studi funzionali. Tuttavia, senza amplificazione molecolare disponibile per queste molecole, rilevamento del metaboloma esige sensibilità eccezionale utilizzando la spettrometria di massa (MS), che è la tecnologia scelta per analisi del metabolita.
Cella singola MS è un insieme di tecnologie con sufficiente sensibilità per misurare i metaboliti in singole cellule (Vedi recensioni 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Riproducibile campionamento delle cellule ed efficiente estrazione di metaboliti sono essenziali per l’individuazione dei metaboliti in singole cellule. La dissezione della intero-cellula delle cellule identificate da embrioni di Xenopus ha permesso la caratterizzazione di piccole molecole e peptidi16. Altri approcci utilizzano micropipette a campione singole celle dal vivo seguite da rilevamento tramite ionizzazione electrospray (ESI) MS. Ad esempio, i metaboliti sono stati misurati in pianta o cellule di mammifero di cella singola video MS17, pressione sonda18, singola sonda19e microscopia forza fluidico20, fra le altre tecniche21, 22,23,24. Inoltre, incorporazione di separazione chimica prima ionizzazione nel flusso di lavoro MS unicellulare semplifica in modo efficiente il metaboloma, attenuando le potenziali interferenze durante la generazione di ioni prima del rilevamento. D’importanza, separazione fornisce anche informazioni specifiche del composto per assistere in identificazioni molecolari. Elettroforesi capillare (CE) è stato utilizzato per rilevare metaboliti nei neuroni2726 o microsampled singoli dissecata25,, acquisizione della piccolo-molecola differenze tra fenotipi del neurone. Abbiamo recentemente adattato CE a tandem ESI MS per abilitare il rilevamento del livello di traccia di centinaia di metaboliti in singole celle che sono stati sezionati da primi embrioni di Xenopus laevis16,28. Questi studi hanno rivelato sorprendenti differenze metaboliche tra cellule embrionali in una fase iniziale di sviluppo e ha portato alla scoperta di metaboliti con precedentemente sconosciuto inerente allo sviluppo impatti16.
Qui forniamo un protocollo che abilitato il rilevamento dei metaboliti in singole cellule direttamente in un embrione di vertebrati dal vivo usando della microsonda unicellulare CE-ESI-MS29,30. L’organismo di modello scelto è la 8-32-cellula dell’embrione X. laevis , anche se l’approccio è applicabile anche alle successive fasi di sviluppo e altri tipi di organismi modello. Questo protocollo utilizza capillari affilati con il controllo traduzionale multiasse sotto la Guida di un sistema di imaging ad alta risoluzione per aspirare un ~ 10 nL parte delle cellule identificate in situ nell’embrione di sviluppo morfologicamente complessa. Questa microsonda è scalabile a celle più piccole e opera in pochi secondi, che è sufficientemente veloce per tenere traccia di stirpi delle cellule nell’embrione. Dopo l’estrazione polare o piccole molecole apolari, quali metaboliti e peptidi, dal campione prelevato in ~ 4-5 µ l di soluzione estrazione, un ~ 10 nL dell’estratto risultante viene analizzata in una piattaforma CE fuoriserie sillabata ad uno spettrometro di massa ESI. Costruzione e funzionamento della piattaforma CE-ESI-MS sfrutta i protocolli descritti altrove. 31 , 32 l’interfaccia CE-ESI co-axial è costruito come descritto altrove. 31 questa piattaforma è mantenuta in regime di spruzzatura getto a cono per raggiungere livello di traccia sensibilità con una capacità per quantificazione sopra una gamma dinamica (relativo28,29,30 Registro-ordine di 4-5 o assoluto16). La piattaforma di CE-ESI-MS offre un limite inferiore di 60-amol di rilevamento con 8% deviazione standard relativa (RSD) nella quantificazione sopra una gamma testata di 10 nM a 1 µM per piccole molecole16, che sono sufficienti per caratterizzare metaboliti endogeni in X. laevis cellule. Microprobed cellule continuano a dividersi il progredire dell’embrione attraverso sviluppo30, consentendo analisi temporalmente e spazialmente risolto del metabolismo cellulare. Infatti, la cella singola CE-ESI-MS può essere utilizzato per trovare differenze metaboliche tra cellule che occupano il dorso-ventrale16,29, animale-vegetale16e sinistra-destra28 assi dello sviluppo così come le cellule che formano il tessuto neurale fated lignaggio dorsale da una cellula progenitrice comune in X. laevis30. Oltre a una query su differenze metaboliche tra le singole celle embrionali nelle diverse fasi dello sviluppo dell’ embrione X. laevis 30, prevediamo che i protocolli descritti qui sono applicabili a una vasta gamma di biomolecole e microsampled di cellule singole da diversi stadi di sviluppo embrionale, così come altri tipi di cellule e organismi modello. Inoltre, la microsonda potrebbe essere utilizzata per Microcampionamento, mentre un’altra piattaforma compatibile con minuscoli campioni potrebbe essere usata per separazione e/o caratterizzazione di biomolecole.
Protocol
Representative Results
Discussion
MicroProbe CE-ESI-MS consente la caratterizzazione diretta dei metaboliti in singole cellule in vivo, liberamente lo sviluppo di embrioni. Nel cuore dell’approccio sono due tecniche sottocomponenti, vale a dire in situ capillare microcampionamento e ad alta sensibilità CE-ESI-MS. rispetto alla dissezione di cellule intere, Microcampionamento capillare ha il vantaggio di funzionamento veloce (pochi secondi vs 5 min / cella di dissezione), compatibilità con la complessa morfologia tridimensionale di embrioni e s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute sovvenzioni GM114854 (a P.N.) e CA211635 (a P.N.), Arnold e Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator concedere (a P.N.), il premio DuPont giovane professore (a P.N.), la società americana per la massa Premio ricerca spettrometria (a P.N.) e COSMOS Club Fondazione borse di studio (per R.M.O. ed E.P.P). Le opinioni e conclusioni espresse in questa pubblicazione sono unicamente quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale delle fonti di finanziamento.
Materials
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
Riferimenti
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
- Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
- Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in ‘omics’. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
- Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
- Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
- Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
- Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
- Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
- Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
- Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
- Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
- Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
- Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
- Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
- Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
- Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
- Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V., Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. . Methodologies for Metabolomics. , 119-139 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
- Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
- James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
- Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
- Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
- Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
- Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
- Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
- Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
- Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
- Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1967).
- Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).
