Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)
Summary
Describimos los pasos que permiten muestreo rápido in situ de una pequeña porción de una célula individual de alta precisión y mínima invasión, mediante micro-muestras basadas en el tubo capilar, para facilitar la caracterización química de una instantánea de la actividad metabólica en embriones vivos utilizando una plataforma de espectrometría de masas y electroforesis capilar célula hecha a la medida.
Abstract
La cuantificación de moléculas pequeñas en las células provoca nuevos potenciales para la mejor comprensión de los procesos básicos que subyacen el desarrollo embrionario. A activar sola célula investigaciones directamente en embriones vivos, nuevos enfoques analíticos son necesarios, especialmente aquellos que son sensibles, selectivos, cuantitativa, robusto y escalable para tamaños diferentes de la célula. Aquí, presentamos un protocolo que permite el análisis en situ del metabolismo en las células en el libre desarrollo de embriones de la rana con garras sudafricana (Xenopus laevis), un modelo potente en biología celular y del desarrollo. Este enfoque utiliza una microsonda capilar para aspirar una porción definida de células identificadas en el embrión, dejando las células vecinas intactas para posterior análisis. El contenido celular recogido es analizado por una interfaz de microescala electroforesis capilar electrospray ionización (CE-ESI) acoplada a un espectrómetro de masas tándem de alta resolución. Este método es escalable a diferentes tamaños de célula y compatible con la compleja estructura tridimensional del embrión en desarrollo. Por ejemplo, demostramos eso microprobe que unicelular CE-ESI-MS permite la aclaración de la heterogeneidad metabólica de la célula que se desarrolla como una célula progenitora da origen a descendientes durante el desarrollo del embrión. Además de la célula y biología de desarrollo, los protocolos de análisis unicelular aquí descritos son susceptibles a otros tamaños de célula, tipos celulares o modelos animales.
Introduction
Una comprensión integral del desarrollo embrionario requiere caracterización de todos los cambios moleculares que se despliegan en cada célula del organismo en desarrollo. Secuenciación de próxima generación con amplificación molecular permite medición profunda de transcriptomas unicelular1 en desarrollo sistemas2,3, mucho menos se sabe sobre el conjunto de moléculas más pequeñas producido en células embrionarias, incluyendo las proteínas y, especialmente, metabolitos (masa molecular < Da ~ 1.500). Con una respuesta rápida y dinámica a los eventos intrínsecos y extrínsecos, el metaboloma sirve como un poderoso descriptor del estado molecular de la célula. El metaboloma unicelular, por lo tanto, aumenta el potencial para seguir el desarrollo espacial y temporal de la heterogeneidad celular en el embrión y para identificar nuevas moléculas para estudios funcionales. Sin embargo, sin amplificación molecular disponible para estas moléculas, detección del metaboloma exige una sensibilidad excepcional utilizando espectrometría de masas (MS), que es la tecnología de elección para el análisis de metabolitos.
Sola célula MS es una colección de tecnologías con suficiente sensibilidad para medir metabolitos en las células (ver comentarios 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Muestreo reproducible de las células y eficiente extracción de los metabolitos son esenciales para la acertada detección de metabolitos en las células. Disección de célula entera de identificadas células de embriones de Xenopus ha permitido la caracterización de pequeñas moléculas y péptidos16. Otros enfoques utilizan Micropipetas para células vivas individuales seguidas de detección mediante la ionización por electrospray (ESI) MS de la muestra. Por ejemplo, los metabilitos fueron medidos en planta o en células de mamífero por unicelular video MS17, presión sonda18, sonda solo19y fuerza fluídica microscopia20, entre otras técnicas21, 22,23,24. Además, incorporación de separación química antes de la ionización en el flujo de trabajo de MS sola célula eficiente simplifica el metaboloma, aliviando así posibles interferencias durante la generación de iones antes de la detección. Lo importante, separación también proporciona información específica del compuesto para ayudar en la identificación molecular. Electroforesis capilar (CE) se ha utilizado para detectar metabolitos en disecado solo25,26 o microsampled27las neuronas, captando moléculas pequeñas diferencias entre fenotipos de neurona. Recientemente adaptamos CE al tándem ESI MS para permitir la detección de nivel de seguimiento de cientos de metabolitos en las células individuales que fueron disectadas desde tempranos embriones de Xenopus laevis16,28. Estos estudios revelaron sorprendentes diferencias metabólicas entre las células embrionarias en una fase temprana de desarrollo y condujeron al descubrimiento de metabolitos con el previamente desconocido impactos del desarrollo16.
Aquí proporcionamos un protocolo que permitió la detección de metabolitos en las células en un embrión vertebrado vivo utilizando microsonda unicelular CE-ESI-MS29,30. El organismo modelo elegido es la 8-a-32-célula X. laevis embrión, aunque el enfoque es también aplicable a etapas posteriores de desarrollo y otros tipos de organismos modelo. Este protocolo utiliza capilares afilados con varios eje control traduccional bajo dirección por un sistema de proyección de imagen de alta resolución para aspirar una porción de nL ~ 10 de células identificados en situ en el embrión en desarrollo morfológicamente complejo. Esta microsonda es escalable a células más pequeñas y opera dentro de los segundos, que es lo suficientemente rápido para seguir linajes celulares en el embrión. Después de extracción polar o apolar de moléculas pequeñas, como metabolitos y péptidos, de la muestra recogida en ~ 4-5 solución de extracción μl, un ~ 10 nL del extracto resultante se analiza en una plataforma a la medida de CE separe a un espectrómetro de masas ESI. Construcción y operación de la plataforma de CE-ESI-MS se basa en protocolos descritos en otras partes. 31 , 32 la interfaz coaxial de CE-ESI es construida como se describe en otra parte. 31 esta plataforma se mantiene en el régimen cono-chorro rociado lograr sensibilidad de seguimiento-nivel capacidad de cuantificación sobre un rango dinámico del orden de registro de 4-5 (relativa28,29,30 o absoluta16). La plataforma de CE-ESI-MS ofrece un 60-amol límite inferior de detección con 8% de desviación estándar relativa (RSD) en la cuantificación en un rango probado de 10 nM y 1 μm para moléculas pequeñas16, que son suficientes para caracterizar metabolitos endógenos en X. Laevis de las células. Microprobed células continúan dividir a medida que avanza el embrión a través de desarrollo30, lo que permite análisis temporal y espacialmente resueltos de metabolismo celular. De hecho, unicelular CE-ESI-MS puede usarse para encontrar las diferencias metabólicas entre las células que ocupan el dorsal ventral16,29, animal-vegetal16y ejes del desarrollo de izquierda a derecha28 así como células forman el linaje predestinado dorsal de tejido neural de una célula progenitora común en X. laevis30. Además de consultar diferencias metabólicas entre las células embrionarias individuales en diferentes etapas de desarrollo del embrión X. laevis 30, Anticipamos que los protocolos descritos aquí son aplicables a una amplia gama de biomoléculas y microsampled de las células de diferentes etapas de desarrollo embrionario, así como otros tipos de células y organismos modelo. Además, la microsonda podría utilizarse para microsampling, mientras que otra plataforma compatible con minúsculas muestras podría ser utilizada para la separación y caracterización de biomoléculas.
Protocol
Representative Results
Discussion
MicroProbe CE-ESI-MS permite la caracterización directa de los metabolitos en las células en vivo, libremente desarrollar embriones. En el corazón de la estrategia son dos subcomponentes técnicos, es decir en situ capilar microsampling y alta sensibilidad CE-ESI-MS. Comparado con celulares disección, microsampling capilar tiene la ventaja de un funcionamiento rápido (algunos segundos y 5 minutos / celular por disección), compatibilidad con la morfología tridimensional complejo de embriones y escalabilida…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud subvenciones GM114854 (a p) y CA211635 (a p), Arnold y Mabel Beckman Fundación Beckman joven investigador conceden (a p), el premio DuPont joven profesor (a p), la sociedad americana para la masa Premio de investigación de espectrometría (a p) y becas de la Fundación del Club COSMOS (a R.M.O. y E.P.P.). Las opiniones y conclusiones expresadas en esta publicación son únicamente las de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de las fuentes de financiación.
Materials
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
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