Descriviamo i passaggi che permettono il campionamento veloce in situ di una piccola parte di una singola cella con alta precisione e l'invasione minima utilizzando micro-campionamento basato sul capillare, per facilitare la caratterizzazione chimica di uno snapshot di attività metabolica in vivere gli embrioni utilizzando una piattaforma di spettrometria di massa e di elettroforesi capillare su misura singola cella.
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Articolo metodologico
Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)
In questo articolo
Sommario
Abstract
La quantificazione di piccole molecole in singole cellule genera nuove potenzialità per comprendere meglio i processi di base che sottendono lo sviluppo embrionale. Per abilitare unicellulare indagini direttamente in embrioni dal vivo, nuovi approcci analitici sono necessari, specialmente quelli che sono sensibile, selettiva, quantitativa, robusta e scalabile per celle di diverse dimensioni. Qui, presentiamo un protocollo che consente l'analisi in situ di metabolismo in singole cellule liberamente lo sviluppo di embrioni di Rana artigliata dell'africano del Sud (Xenopus laevis), un potente modello in biologia cellulare e dello sviluppo. Questo approccio utilizza una microsonda capillare per aspirare una porzione definita da singole cellule identificate nell'embrione, lasciando le cellule vicine intatto per la successiva analisi. Il contenuto della cella raccolti è analizzato da un interfaccia su microscala elettroforesi capillare electrospray ionizzazione (CE-ESI) accoppiato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione tandem. Questo approccio è scalabile a vari formati di cella e compatibile con la struttura tridimensionale complessa dell'embrione in via di sviluppo. Ad esempio, dimostriamo che microsonda che unicellulare CE-ESI-MS consente la delucidazione di eterogeneità metabolica delle cellule che si dispiega come una cellula del progenitor dà luogo a discendenti durante lo sviluppo dell'embrione. Oltre a cellulare e biologia dello sviluppo, i protocolli di analisi unicellulare descritti qui sono suscettibili di altre celle di dimensioni, tipi cellulari o modelli animali.
Introduzione
Una comprensione globale dello sviluppo embrionale richiede la caratterizzazione di tutti i cambiamenti molecolari che si dipanano in ogni cellula dell'organismo in via di sviluppo. Mentre la Next-Generation Sequencing con amplificazione molecolare permette profonda misura di singola cellula trascrittomi1 in sviluppo sistemi2,3, considerevolmente di meno è conosciuto circa la suite di molecole più piccole prodotta in singole cellule embrionali, tra cui proteine e, soprattutto, metaboliti (massa molecolare < Da ~ 1.500). Con una risposta veloce e dinamica agli eventi intrinseci ed es....
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Protocollo
Tutti i protocolli relativi alla manutenzione e gestione di Xenopus laevis sono stati approvati dal comitato di uso alla George Washington University e istituzionali Animal Care (IACUC no. A311).
1. preparazione del campionamento strumenti, Media, solventi e degustazione di piatti
- Preparare la soluzione di Steinberg (SS) 1x sciogliendo i seguenti sali in acqua ultrapura (~18.2 MΩ.cm a 25 ° C) nel seguente ordine e alle concentrazioni indicate seguendo uno standard di protocollo33: cloruro di sodio (58,2 mM), cloruro di potassio ( 0,67 mM), nitrato di calcio (0,34 mM), solfato di magnesio (0,83 mM....
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Risultati
Abbiamo recentemente impiegato della microsonda unicellulare CE-ESI-MS per la caratterizzazione di metaboliti in singole cellule identificate nello sviluppo liberamente di Xenopus laevis embrioni29,30. La microsonda consente il veloce (~ 5 sec/cell), in situ aspirazione di ~ 10 nL da una singola cella, le aspirazioni multiple della stessa cella o più celle diverse entro la stesse o versioni successive fasi dello .......
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Discussione
MicroProbe CE-ESI-MS consente la caratterizzazione diretta dei metaboliti in singole cellule in vivo, liberamente lo sviluppo di embrioni. Nel cuore dell'approccio sono due tecniche sottocomponenti, vale a dire in situ capillare microcampionamento e ad alta sensibilità CE-ESI-MS. rispetto alla dissezione di cellule intere, Microcampionamento capillare ha il vantaggio di funzionamento veloce (pochi secondi vs 5 min / cella di dissezione), compatibilità con la complessa morfologia tridimensionale di embrioni e sca.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute sovvenzioni GM114854 (a P.N.) e CA211635 (a P.N.), Arnold e Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator concedere (a P.N.), il premio DuPont giovane professore (a P.N.), la società americana per la massa Premio ricerca spettrometria (a P.N.) e COSMOS Club Fondazione borse di studio (per R.M.O. ed E.P.P). Le opinioni e conclusioni espresse in questa pubblicazione sono unicamente quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale delle fonti di finanziamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per terreni di coltura embrionale | |||
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Solfato di magnesio | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Nitrato di calcio | Sigma | Aldrich C1396 | |
| Cisteina | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma cloridrato | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Metabolita Solventi da estrazione | |||
| Acetonitrile (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A955 | |
| Metanolo (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A456 | |
| Acqua (grado LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Commenti |
| Solventi e standard per CE-ESI-MS | |||
| Acido formico (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Metanolo (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Acqua (grado LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Cloruro di acetilcolina | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| >Configurazione di fabbricazione della microsonda | |||
| Estrattore Micropippette | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | ||
| Pinze affilate fini: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Resistente alla corrosione e autoclavabile. |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Configurazione del campionamento della microsonda | |||
| Micromanipolatore | Eppendorf, Hauppauge, NY | Stereomicroscopio TransferMan 4r | |
| Nikon | SMZ18 | Deve essere isolato dalle vibrazioni. | |
| Illuminatore, ad es. Colli d'oca, | Nikon | C-FLED2 | |
| Microiniettore | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Pipette di trasferimento (plastica, monouso) | Fisher Scientific | 13-711-7M, | |
| piastra di Petri 60 mm e 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pipette Pasteur in vetro (borosilicato, monouso) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuga | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| CE-ESI-MS Configurazione | |||
| Alimentatore ad alta tensione | Spellman | CZE1000R | L'HVPS può essere controllato a distanza utilizzando un programma a bassa tensione generato da un personal computer. Attenzione: l'alta tensione presenta il rischio di scosse elettriche; Tutte le parti di collegamento devono essere messe a terra o accuratamente schermate per evitare l'esposizione accidentale degli utenti. |
| Pompe a siringa (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscopio | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscopio in grado di ingrandire 4,5 volte, dotato di un illuminatore per monitorare la modalità di spruzzatura dell'interfaccia CE-ESI. |
| Stadio di traslazione XYZ | Thorlabs | PT3 | |
| Stadio di traslazione XYZ | Costruito | Questa piattaforma è in grado di caricare quantità di nanolitri di campione nel capillare di separazione tramite iniezione idrodinamica e di fornire il BGE per CE. Entrambe le interfacce descritte in questo lavoro sono state in grado di iniettare 6– 10 nL di campione entro 1 minuto in un capillare di separazione da 1 m | |
| Fiale per campioni in acciaio inossidabile | Fiala | ||
| Capillare | |||
| (40 µ m/105 µ m ID/OD; 100 cm) | Tecnologie Polymicro | TSP040105 | |
| capillare in silice fusa (75 &; micro; m/360 µ m ID/OD; 100 cm) | Tecnologie Polymicro | TSP075375 | |
| Emettitore in acciaio inox con punte smussate (130/260 &; micro; m ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | Per prestazioni migliori, tagliare al laser e lucidare con precisione la punta dell'emettitore. |
| Siringhe (a tenuta di gas): 500 - 1000 & micro; L | Hamilton Co. | Multimetro digitale 1750TTL | |
| Fluke | Fluke 117 | ||
| Spettrometro di massa ad alta risoluzione | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | Spettrometro di massa tandem ad alta risoluzione dotato di un'interfaccia di pressione atmosferica configurata per ESI |
| Miscela di sintonizzazione per la calibrazione dello spettrometro di massa | Tecnologie Agilent | ESI-L G1969-85000 | |
| Analisi dei dati 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Attrezzatura ausiliaria | |||
| Concentratore a vuoto in grado di funzionare a 4– 10 gradi; C | Labconco | 7310022 | |
| Microbilancia analitica (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Congelatore (-20 ° C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Congelatore (-80 ° C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Incubatore refrigerato | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
Riferimenti
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assem....
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Ristampe e permessi
