Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정
Summary
이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.
Abstract
이 기술의 목적은 많은 수의 다 당 류 캡슐 측정에 대 한 일관 된, 정확한, 및 관리 프로세스를 제공 하입니다.
첫째, 임계값 이미지 강도 값 고유 각 이미지에 대 한 계산에 따라 생성 됩니다. 그런 다음 원형 개체와 확고 원 Hough 변환 (CHT) 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드에 따라 검색 됩니다. 마지막으로, 검색 된 셀 캡슐과 시체 중심 좌표와 반지름 크기, 일치 하 고 데이터 관리 스프레드시트에서 사용자에 게 보내집니다.
이 기법의 장점은 간단 하지만 중요 한입니다. 첫 번째, 이러한 계산 인간 보다는 알고리즘에 의해 수행 되기 때문에 정확성과 신뢰성 증가 된다. 정확성이 나 신뢰성 얼마나 많은 샘플 분석에 아무 하락이 있다. 둘째,이 이렇게 캡슐 측정 연구소에 의해 다릅니다 현재 상황 대신 Cryptococcus 필드에 대 한 잠재적인 표준 운영 절차를 설정 합니다. 셋째, 주어진 있다는 수동 캡슐 측정 느리고 단조, 자동화에 차례로 점점 강력한 통계 및 높은 처리량 데이터 분석을 용이 하 게 하는 효 모 세포의 큰 숫자에 빠른 측정 수 있습니다.
이 기술의 주요 제한 방법에서 온 알고리즘 기능. 첫째, 알고리즘 서클 생성할 것 이다. 동안 Cryptococcus 세포와 그들의 캡슐에 원형 형태, 비 원형 물체 감지에이 기술을 적용할 것은 어려울 것 이다. 둘째, 서클 감지는 어떻게 인해 CHT 알고리즘 여러 클러스터 된 서클의 바깥쪽 가장자리에 따라 거 대 한 의사 원을 검색할 수 있습니다. 그러나, 의사 원 안에 잡힌 안하고 셀 시체 수 있습니다 쉽게 감지 되며 결과 데이터 집합에서 제거.
이 기술은 인도 잉크 밝은 분야 현미경 검사 법;에 따라 Cryptococcus 종의 원형 다 당 류 캡슐을 측정 하기 위한 의미 그것은에 적용 될 수 있지만 다른 대비 원형 개체 측정을 기반으로 합니다.
Introduction
Cryptococcus neoformans immunosuppressed 인구에서 주로 인간의 질병와 관련 된 전세계 편 발견 병원 성 효 모 이다. C. neoformans 전염병1인 사하라 총 연간 사망자의 중요 한 원인이 가장 주목할만 하 게 차지 한다. Cryptococcal 감염의 주요 임상 징후는 감염 된 대 식 세포 (트로이 목마 방법)에 전송 하 여 중앙 신경 시스템의 침공을 다음과 같이 meningoencephalitis 또는 혈액-뇌 장벽에의 직접 교차점. C. neoformans 는 인체 온도, urease 활동, melanization, 및 다 당 류 캡슐2의 형성에서 복제 하는 기능을 포함 한 몇 가지 독성 요소를 표현 한다. 다 당 류 캡슐 glucuronoxylomannan와 glucoronoxylomannangalactan 고분자와 기능 호스트 면역 반응2등 환경 스트레스 요인에 대 한 보호벽으로 반복 구성 됩니다.
Cryptococcal 다 당 류 캡슐 크기의 크기 일관 되 게 연관 되지 않은 독성과, 비록 증거가 병 인2,3,,45에 있는 요인 다는 것 6,7. 캡슐 크기 염 병 리6와 연결, 제어 Cryptococcus 감염5, 하 대 식 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다 이며 독성의 손실8결 석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 캡슐 크기 측정은 일반적인 cryptococcal 연구, 하지만 아무 fieldwide 캡슐 측정 하는 방법에 대 한 표준.
현재, C. neoformans 다 당 류 캡슐 측정 현미경 이미지, 수동 측정에 기반 하 고 실험실9,10, 마다 이미지 및 측정 취득의 정확한 방법 11. 이 방법에는 즉시 관심사는 일부 연구 요구 정확도 신뢰성 유지를 어렵게 만드는 개별 측정의 수천의 수집 이다. 또한, 결과 게시 하는 경우에 종종 있다 측정 방법의 부적당 한 설명. 많은 출판물 어떻게 그들의 측정 가져온, 설명 하지 어떤 초점 비행기 사용 되었다, 그들은 한 측정을 사용 하거나 몇 가지, 또는 다른 평균 반지름 또는 지름, 사용 여부를 어떻게 그들은 캡슐 식별에 대 한 임계값을 결정 세부 사항입니다. 일부 출판물만 상태는 프로그램으로 그들의 방법 사용 되었다, 예를 들어, “어도비 포토샵 c s 3의 사용 된 셀 측정 하”11. 재현성 어려울 수 있습니다 표준화 및 정보 보고의이 부족이 불가능 한 경우. 인간의 시력, 컴퓨터 밝기, 현미경 설정 차이 슬라이드 조명, 및 다른 요인 뿐만 아니라 개인 간의 하지만 샘플, 사이 계산 픽셀 강도 값의 비율에 따라 일정 하 게 유지 됩니다 반면 변화할 수 있다 고 샘플 사이의 적용 가능 합니다. 이 기술은 없는 없음 전에 필드에 대 한 캡슐 크기를 측정 하는 표준화, 신속, 정확 하 고 간단한 기술 제공의 맥락에서 생성 되었습니다.
앞에서 설명한 대로 CHT 알고리즘은 오래 된, 그리고 스크립트를 자동으로 검색 하는 원 전에 작성 되었습니다. 이 메서드는 어디 다른 스크립트 짧은을 것 이라고 하는 두 가지 영역에서 향상 됩니다. 첫째, 단순히 서클 감지 충분 하지 않습니다, cryptococcal 세포와 두 가지 동그라미 서로 관하여 감지 해야 하기 때문에. 이 방법은 특히 감지 캡슐 내에서 셀 시체, 둘 사이 차별 하 고 관련 몸 캡슐 쌍에 대해서만 계산을 수행. 둘째, 심지어 때 동일한 프로토콜, 다른 수 사관 다음으로 끝날 것 이다 다른 이미지 획득. 탐정 제어할 모든 알고리즘 매개 변수를 함으로써,이 도구는 수집 방법의 광범위 한 범위에 맞게 조정할 수 있습니다. 표준화 범위, 목표, 필터, 그리고에 대 한 필요가 있다.
이 기술은 이미지 내 원 그들의 배경과 그 명암을 감지 하는 탐정 필요 어떤 상황 든 지에 쉽게 적용할 수 있습니다. 두 원 가볍고 어두운 그들의 백그라운드 검출 될 수 있다, 보다,이 기술을 사용 하 여 측정.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술의 중요 한 단계는 인도 잉크 슬라이드를 준비 하 고 현미경 이미지를 획득. 알고리즘의 다양 한 슬라이드와 이미지 기술 성공적으로 테스트 되었습니다 동안 권장된 프로토콜이이 원고에 설명 되어 있습니다. 다 당 류 캡슐이이 입자는 너무 커서 다 당 류 fibril 네트워크 침투 캡슐의 도메인에서 인도 잉크 입자의 배제에 기반으로 감지 됩니다. 인도 잉크 제외 어두운 배경 위에 밝은 원 발?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 누구의 슬라이드 두 번째 인간의 측면-의해-측면 비교로 서 사용 된 안토니 보 웬 사 브리 나 놀란 그 슬라이드 3 인간의 측면-의해-측면 및 두 번째 현미경 비교로 사용 했다 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
Riferimenti
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