Detta protokoll beskriver mätning av epiteliala barriären permeabilitet i realtid efter farmakologisk behandling i human intestinal organoids använder fluorescerande mikroskopi och levande cell mikroskopi.
Framsteg inom 3D kultur av intestinal vävnader erhålls genom biopsi eller genereras från pluripotenta stamceller via riktad differentiering, har resulterat i sofistikerade in vitro- modeller av tarmslemhinnan. Att utnyttja dessa framväxande modellsystem kräver anpassning av verktyg och tekniker som utvecklats för 2D kultur system och djur. Här, beskriver vi en teknik för att mäta epiteliala barriären permeabilitet i human intestinal organoids i realtid. Detta sker genom Mikroskop fluorescently-märkt dextran och bildbehandling på ett inverterat Mikroskop som är utrustat med epifluorescerande filter. Realtid mätning av barriär permeabiliteten i intestinal organoids underlättar generationen högupplösta tidsmässiga data i human intestinal epitelvävnad, även om denna teknik kan också tillämpas på fast tidpunkt imaging metoder. Detta protokoll är lätt anpassningsbar för mätning av epiteliala barriären permeabilitet efter exponering för farmakologiska agenter, bakterieprodukter eller toxiner eller levande mikroorganismer. Med smärre ändringar, detta protokoll kan också fungera som en allmän primer på Mikroskop av intestinal organoids och användare kan välja att komplettera protokollet med ytterligare eller alternativa nedströms tillämpningar efter Mikroskop.
Intestinal epitel bildar en selektiv barriär som medierar riktad transport av näringsämnen, H2O, joner och slaggprodukter samtidigt minimera ospecifik diffusion-medierad utbyte av andra partiklar mellan lumen och den mesenkymala vävnader och allt blod leverans1,2. Ospecifik genomträngligheten av epitelial tarmbarriären har länge ansetts vara en funktionell nyckelparameter i hälsa och sjukdom3,4,5,6, som återspeglar graden av spridning av små molekyler över epitelet via det paracellular utrymmet. Mätning av epiteliala barriären permeabilitet kan utföras på djur modeller7 och i mänskliga patienter8 genom intag av Laktulos, som har inga specifika transportör i mag-tarmkanalen, och den efterföljande samlingen och mätning av Laktulos koncentrationer i perifert blod. Alternativa intagna markörer för barriärfunktion såsom fluorescently märkt kolhydrater är också tillgänglig9,10. Detta tillvägagångssätt har anpassats för tarmens epitelceller kulturer odlas på Transwell stöder11, en förenklad metod som möjliggör större experimentell kontroll men har också kritiserats som en dålig prediktor för i vivo permeabilitet på grund av avsaknad av differentierade epitelceller subtyper och vävnad struktur12. Med kammare representerar ännu ett annat tillvägagångssätt och möjliggör mätning av epitelial barriärfunktion i hela tarmslemhinnan ex vivo13. Tillämpningen av denna teknik begränsas ofta av vävnad tillgänglighet och villkor13,14. Således behövs nya metoder som balanserar reproducerbarhet och genomströmning fysiologiska betydelse.
Senaste utvecklingen i in vitro- organogenesen har lett till antagandet av 3D vävnadsodling modellsystem som en sofistikerad plattform för går igenom dynamiken i komplexa vävnader15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. I synnerhet mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) härrör human intestinal organoids (HIOs)19,24 har dykt upp som reproducerbara och experimentellt eftertraktansvärda modellsystem för att studera värd-mikrobiella interaktioner och epiteliala barriären dynamics25,26,27,28. Likaså, mänsklig vävnad-derived organoids (även känd som enteroids) kan härledas från en enkel biopsi förfarande och kan användas som ett fogligt system för att studera människans fysiologi och sjukdom15,29,30. Mikroskop av human intestinal organoids möjliggör leverans av experimentella föreningar25 eller levande mikrober25,31,32,33 till de apikala epitelial yta av organoid lumen. Leslie och Huang et al. 25 nyligen anpassat denna teknik för att mäta barriär permeabilitet i HIOs microinjected med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) märkt dextran efter exponering för bakteriella toxiner.
Detta protokoll är avsedd som en vägledning för mätning av epiteliala barriären permeabilitet i hPSC-derived HIOs och vävnad-derived HIOs använder fluorescerande mikroskopi. Med smärre ändringar, kan det också fungera som en allmän primer på Mikroskop av HIOs med experimentella föreningar. Användare kan komplettera detta protokoll med ytterligare eller alternativa nedströms tillämpningar efter Mikroskop.
Detta protokoll fastställs en general-purpose metod för Mikroskop hPSC-derived HIOs och vävnad-derived intestinal organoids och mätning av epiteliala barriären permeabilitet i realtid. Vi har också visat vår inställning till analys och tolkning av de data som genereras med hjälp av dessa metoder. Med tanke på växande antagandet av intestinal organoids modellsystem16,20,21,28 och den långvariga intressen tarmbarriären permeabilitet som en fysiologiskt relevanta funktionella resultatet3,4,5,6, vi räknar med att andra som arbetar inom detta område kommer att kunna tillämpa och bygga vidare på dessa metoder.
I området i närheten finns det flera steg som är avgörande för tillämpningen av denna teknik. Tillgång till högkvalitativa hPSC- eller vävnad härledda HIO vävnad bör fastställas innan omfattande experimenterande med Mikroskop. HIO Makrostrukturell kan vara heterogen, med variation i både storlek och form, även om vävnad identitet och cellulära morfologi är mycket reproducerbara när utnyttja etablerad metodik för att generera HIOs24. Sfäriska HIOs bestående av en enda halvtransparent lumen och mäter cirka 1 mm i diameter är idealiska för Mikroskop och mätning av luminala fluorescens i realtid. I vissa fall misslyckas Mikroskop, vilket leder till kollaps av HIO eller uppenbara läckage av injicerade material. Misslyckade HIOs kan tas bort från kulturen väl efter användarens gottfinnande använder en standard mikropipett. Överväga objektiv som är tillgänglig på en tänkbar plattform när du väljer HIOs för Mikroskop och imaging. I allmänhet 2-4 X objektiv är idealisk för att fånga komplett HIO fluorescerande signalen, även ett 10 X-objektiv kan användas om strömsnål linser inte är tillgänglig eller om de tillgängliga HIOs är < 1 mm i diameter. Tänkbar mjukvaran måste tillåta automatisk avskiljning av fluorescerande bilder på definierade punkter över tid.
Flera ändringar i detta protokoll är möjligt för att passa de experimentella krav. Exempelvis resultaten av tester av barriär kan vara beroende av föreningarna i användning43 molekylär storlek och det kan vara lämpligt att testa dextran preparat med varierande molekylvikt. Brightfield avbildning kan dessutom utföras utöver fluorescens imaging som en indikator på den övergripande strukturella integriteten av vävnad25. När du utför Mikroskop levande bakterier25,28,31,32,33,44, det kan vara nödvändigt att lägga till penicillin och streptomycin eller gentamicin till HIO kultur media före eller efter Mikroskop. Utsidan av microcapillary kommer att kontamineras vid fyllning med bakteriekultur fjädring och detta kan överföras till HIO media. Växelvis, Mikroskop kan utföras på HIOs upphängd i extracellulär matrix (t.ex. Matrigel) utan media, att lägga till media efter Mikroskop är klar. Detta kan begränsa förorening till extracellulära matrix och externa ansikte av HIO. När du planerar mikrobiell tillväxt analyser, kan man behöva ta antibiotika i media efter 1-2 h för att undvika bromsa eller förhindra tillväxt av microinjected organismer.
Slutligen är inser att inte alla forskare kommer att ha tillgång till mikroskopi utrustning lämpar sig för in vitro- imaging, det viktigt att påpeka att de procedurer som beskrivs i detta protokoll för datainsamling fluorescens kan tillämpas på bilder tagna vid fasta tidpunkter använder standard epifluorescerande mikroskopi utan automatiserad bild fånga eller miljökontroll. Exempel på detta tillvägagångssätt kan hittas i betänkandena av Leslie och Huang et al. 25, som undersökte C. difficile toxin aktivitet i hPSC-derived intestinal organoids och Karve och Pradan o.a. 44, som undersökte epiteliala barriären permeabilitet i liknande hPSC-derived intestinal organoids microinjected med levande E. coli. Manuell manövrering av bildåtergivningsutrustning kan resultera i större variation och svårigheter i normalisera fluorescerande signalen. När utför manuell avbildning av FITC-dextran injiceras HIOs är det väsentligt att upprätthålla en fast förstoring, fluorescerande excitation intensitet och exponeringstider i hela experimentet att undvika snedvridande fluorescerande intensitet mätningarna.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Drs. Stephanie Spohn och Basel Abuaita för många användbara diskussionerna om organoid Mikroskop. JRS stöds av Intestinal Stem Cell Consortium (U01DK103141), ett forskningssamarbete projekt finansierat av det nationella institutet för Diabetes och mag och njure sjukdomar (NIDDK) och nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID). JRS och VBY stöds av NIAID romanen, alternativ modellsystem för inlåtande sjukdomar (NAMSED) consortium (U19AI116482). DRH stöds mekanismer av mikrobiell patogenes utbildning bidraget från det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar (NIAID, T32AI007528) och klinisk och translationell Science award till Michigan Institutet för klinisk och hälsa Forskning (UL1TR000433).
Komplett datafiler och data analys-kod som används i detta manuskript finns på https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) | Bioworld | 405200081 | |
Cell matrix solution (Matrigel) | Corning | 354230 | |
Deltavision RT live cell imaging system | GE Life Sciences | 29065728 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/ |
Camera | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
softWoRx Imaging software | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
Biosafety cabinet | Labconco | Cell Logic+ | http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262 |
1X PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Advanced DMEM-F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
B27 supplement (50X) | Life Technologies | 17504044 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
L-glutamine (100X) | Life Technologies | 25030-081 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
HEPES buffer | Life Technologies | 15630080 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
Manipulator | Narshge | UM-3C | |
Micromanipulator | Narshge | UM-1PF | |
Pipette Holder | Narshge | UP-1 | Alternate to Xenoworks pipette holder |
Magnetic stand | Narshge | GJ-1 | |
Dissecting scope | Olympus | SX61 | Recommended scope, although other models are likely compatible |
Olympus IX71 Fluorescent microscope | Olympus | IX71 | Included with Deltavision system |
CoolSNAP HQ2 | Photometrics | 29065728 | Included with Deltavision system |
Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein | R&D Systems | 8619-GT-020 | |
EGF | R&D Systems | 236-EG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
R-spondin 1 | R&D Systems | 4645-RS | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
FITC-dextran (4 kDa) | Sigma-Aldrich | 46944 | |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | |
Nunc Lab-Tek II Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | 154526PK | |
Glass filaments | WPI | TW100F-4 | |
Micropipette holder | Xenoworks | BR-MH2 | Preferred device |
Analog Tubing kit | Xenoworks | BR-AT | |
1/16 in clear ferrule | Xenoworks | V001104 | |
1-1.2 mm O-ring | Xenoworks | V300450 |