Her presenterer vi en protokoll for regionnett skanning sonde nanolithography aktiveres av iterativ justeringen av sonden matriser, samt bruken av litografiske mønstre for celle-overflate samhandling studier.
Skanning sonde mikroskopi har aktivert etableringen av en rekke metoder til konstruktiv (‘additiv’) topp-ned fabrikasjon av nanometer-funksjonen. Historisk, har en stor ulempe skanning sonde litografi vært det egentlig lav overføringshastighet enkelt sonde systemer. Dette har blitt håndtert ved bruk av matriser med flere sonder aktivere økt nanolithography gjennomstrømning. For å implementere slike parallelized nanolithography, nøyaktig justering av sonden matriser med substrat overflate er viktig, slik at alle sonder kontakt med overflaten samtidig når litografisk mønstre begynner. Denne protokollen beskriver bruken av polymer penn litografi å produsere nanometer-funksjonen over centimeter store områder, tilrettelagt av bruk av en algoritme for rask, nøyaktig og automatisk justering av sonden matriser. Her viser nanolithography av thiols på gull underlag generering av funksjoner med høy ensartethet. Disse mønstrene er så functionalized med fibronectin for bruk i forbindelse med overflaten-rettet cellen morfologi studier.
Fremgang i nanoteknologi er avhengig av utviklingen av teknikker i stand til å effektivt og pålitelig fabrikere nanoskala funksjoner på overflater. 1 , 2 imidlertid generere slike funksjoner over store områder (flere cm2) pålitelig og relativt lav kostnad er en ikke-triviell oppgave. De fleste eksisterende teknikker, avledet fra semiconductor industry, stole på ablative klima og jordsmonn å dikte “harde” materialer. Flere nylig, litografisk teknikker utledet fra skanning sonde mikroskopi (SPM) har dukket opp som en praktisk og allsidig tilnærming for rask prototyping nanoskala design. 3 SPM-baserte teknikker kan enkelt og raskt ‘skrive’ alle brukerdefinerte mønster. Den mest kjente av disse er dip-penn nanolithography (DPN), utviklet av Mirkin et al.,4 der en skanning probe brukes som en ‘Penn’ overføre en molekylær “blekk” til overflaten produsere funksjoner på en måte analog til skriving. Under forholdene, som en sonde er skannet på en overflate “blekk” molekylene er overført til den overflate via en vann menisk som danner mellom sonden og overflaten (figur 1). DPN dermed lar nanolithographic avsetning av en rekke materialer, inkludert “myke” materialer som polymerer og biomolecules. 5 relaterte teknikker bruker sonder konstruert med kanaler for væskestrømmen, blant annet referert til som “nanopipettes” og ‘nano-fountain penner’, har også blitt rapportert. 6 , 7 , 8
Den største hindringen til bredere anvendelse av SPM-avledet litografi er produksjon, som det krever en svært lang tid å mønster centimeter skala områder med en enkelt sonde. Tidlige forsøk på å løse dette problemet fokusert på parallelization av cantilever-baserte DPN, med både “en-dimensjonale” og “to-dimensjonale” (2D) sonde matriser rapporteres for litografi centimeter store områder. 5 , 9 men disse cantilever matriser er produsert gjennom relativt komplisert må fabrikasjon metoder og er relativt skjøre. Oppfinnelsen av polymer penn litografi (PPL) adressert dette problemet ved å erstatte de standard SPM utkragning med en 2D rekke myk siloxane elastomer sonder limt til et glass lysbilde. 10 enkle sonde installasjonen betydelig reduserer kostnadene og kompleksiteten av mønstre store områder, åpne opp nanolithography for flere programmer. Denne cantilever-fri arkitekturen har også blitt utvidet til hard-tip myk våren litografi,11 som gir en hybrid av myke cellegummi støtte vanskelig silisium tips gir forbedret oppløsning i forhold til mønstre produsert med myke elastomer tips.
En avgjørende faktor i utførelsen av disse 2D matrise teknologiene er at sonden matrisen må være nøyaktig parallell til overflaten underlaget slik at når litografi benyttes, alle sonder kommer i kontakt med overflaten samtidig. Selv en liten forskyvning kan føre til en stor aldersforskjell mønsterstørrelsen fra en side av matrisen til den andre, siden noen sonder komme i kontakt med overflaten tidligere under nedstigningen av array, mens andre vil komme i kontakt senere eller ikke i det hele tatt. 12 nøyaktig justering er spesielt viktig med PPL på grunn av deformability av myke elastomer sonder, der sonder kontakter overflaten tidligere komprimeres, forlate en større fotavtrykk på overflaten.
Det tidlige arbeidet på PPL ansatt rent visuell inspeksjon til justering prosessen, bruker et kamera montert over array for å observere deformasjon av pyramideformet sonder som de ble ført i kontakt med overflaten. 10 justeringen ble dømt av observere hvilken side av sonder kom i kontakt med overflaten først, og deretter justere vinkelen og gjenta prosedyren i en iterativ måte før forskjellen i kontakt på hver side av sonden var utvisket til øyet. Som denne justeringsprosedyren er avhengig av subjektive visuell inspeksjon av operatøren, er reproduserbarhet lav.
Deretter er en mer objektiv tilnærming utviklet, bestående av en kraft-sensor montert i substratet måle kraften ved kontakt av sonder på overflaten. 12 justeringen ble dermed oppnådd ved å justere tilt vinkler for å maksimere kraften, som indikerte at alle sonder hadde samtidig kontakt. Denne metoden viste at justeringen til innen 0.004° av overflaten parallell var mulig. Denne ‘force feedback flate”er nå implementert i helautomatisk systemer i to uavhengige rapporter. 13 , 14 både bruke en triaden av force sensorer montert i substratet eller over matrisen og måle mengden av kraft ved kontakt mellom sonde matriser og overflaten. Disse gir høy presisjon, rapportering avvik ≤0.001 ° 1 cm lengde skala,14 eller ≤ 0.0003 ° over 1.4 cm.13 systemene automatisk justering gir også store besparelser i operatørtiden og totale tiden det tar å fullføre den Litografi prosessen.
En stor anvendelse av høy gjennomstrømming overflaten fabrikasjon aktiveres av denne teknologien er generasjon av celle kultur underlag. Det er nå godt etablert at cellen fenotypen kan manipuleres ved å kontrollere første samspillet mellom cellene og overflaten, og at dette kan forsterkes på nanoskala. 15 spesielt sonde litografi skannemetoder har vist seg å være en lettvint metode for å produsere en rekke nanofabricated overflater for slike cellekulturer eksperimenter. 16 For eksempel overflater presentere nanoskala mønstre selv montert monolayers og ekstracellulær matrix proteiner mal av PPL og DPN har blitt brukt til å studere potensialet i nano-endret materialer i materiale indusert differensiering av stamceller. 17
Denne protokollen beskriver bruken av et modifisert atomic force mikroskopet (AFM) system som gjør store området PPL. Vi detalj påvisning av kraft med flere makt sensorer som middel for å bestemme probe-overflate kontakt, sammen med en algoritme som automatiserer repeterende justering. Påfølgende functionalization av disse mønstrene med ekstracellulær matrix proteiner fibronectin og kultur menneskelige mesenchymal stamceller (hMSC) er beskrevet, som en demonstrasjon av PPL-fabrikkert flater brukes for cellekultur.
Denne protokollen serverer å gi brukerne en praktisk metode for å raskt utføre nanolithographic mønstre med høy ensartethet og kontrollerbar mønsterstørrelsen over store (cm2) områder. Underlag bærer disse store området nanopatterns kan deretter bli ytterligere utdypes for en rekke applikasjoner. En stor anvendelse av denne teknologien er i generering av nanofabricated overflater for celle-overflate samhandling studier. Denne rapporten viser illustrerende eksempler med cellekulturer disse materialene, demonstrere kontroll over hMSC morfologi av nanofabricated underlag.
Avgjørende for denne protokollen er automatisering av justeringsprosedyren (trinn 4) som tillater svært ensartet og høy gjennomstrømming produksjon av funksjoner på overflater, ned nanoskala oppløsning, som muliggjør rask omsetning med cellekulturer eksperimenter. Den polymer penn litografi gjennomført med denne justeringen algoritmen er kjøpedyktig utvikle nanoskala funksjoner i ca 30 min. Reproduserbarhet og nøyaktigheten av automatisk justering, og dermed ensartetheten i mønstret funksjonene, er imidlertid kritisk avhengig av kvaliteten på sonde matriser som er produsert (trinn 1 og 2). Eventuelle feil i forberedelsen som resulterer i sløv, ødelagte eller manglende sonder; som fanget luft kan bobler (trinn 1.5) eller uriktig separasjon av sonder fra master (trinn 1.8) resultere i feil justering og dårlig kvalitet litografi.
Dette rapportert metoden aksjer en begrensning i likhet med andre justering metoder som er avhengige av force feedback. Nøyaktig bestemmelse av når sonder er i kontakt med overflaten er begrenset av behovet for å ta hensyn til bakgrunnen vibrasjoner forårsaket av ambient miljøet og bevegelse av prøven scenen. Generelt, sensorer har en force sensitivitet i µN regime (2 µN i dette tilfellet), men justering algoritmen er utformet for å bare registrere en styrke på minst 490 µN som endelig kontakt mellom sonder og overflaten, for å unngå eventuelle ‘false positiv’ resul ting fra bakgrunnsstøy. 13 derfor, denne metoden har en tendens til å produsere store funksjoner (1-2 µm) siden sonder må utvidet en stor avstand på z-aksen (med en påfølgende høyere styrke) for å registrere kontakt. For å kompensere, mindre funksjoner kan genereres ved å redusere z-aksen avstand reist under litografi trinnet (e.g.inn innstillingen “Svarte” i trinn 5.2.3.2 som 3 µm i stedet for 5 µm).
Likevel, selv med denne begrensningen automatisering algoritmen er stand til å ta en viktig del i anvendelsen av parallelized sonde litografi skannemetoder justering var tidligere mest tid krevende og upresise skritt i den implementering av disse teknikkene. Automatiseringen nå flytter hastighetsbegrensning trinnet av fabrikasjon prosessen fra justeringen av litografiske skrive selv. Mens denne protokollen demonstrerer bruken av denne justeringsprosedyren til PPL, kan rammen brukes til en rekke SPL teknikker som lipid-DPN26 og matrix-assistert litografi27 , samt mulige fremtidige katalytisk sonden systemer. 28
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra en rekke kilder, inkludert UK Engineering og Physical Sciences Research Council (gi refs. EP/K011685/1, EP/K024485/1) og en utdannet studentship for JH; Leverhulme tillit (RPG-2014-292); Wellcome Trust institusjonell strategisk støtte fondet (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); og ved University of Manchester for et universitet Manchester Research Institute (UMRI pumpe grunning fund) og en Presidential doktorgrad stipend til SW. teknisk assistanse av Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) er også takknemlig anerkjent.
Equipment | |||
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage | NanoSurf | P40008 | |
AFM control software | NanoSurf | C3000 | |
Engraving pen | Sigma-Aldrich | Z225568 | |
Plasma Cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 | |
PlasmaFlo | Harrick plasma | PDC-FMG-2 | |
Economy Dry Oxygen Service Pump | Harrick plasma | PDC-OPE-2 | |
Tube Rotator | Stuart | SB3 | |
Vacuum Desiccator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | |
Milli-Q Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ015WW | |
Modular Humidity Generator | proUmid | MHG32 | |
Proline Plus Pipette 100-1000 µL | Sartorius | 728070 | |
Silicon masters | NIL Technology | custom-made | |
Upright snapshot fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
Microscope objectives | Olympus | 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5 | |
Upright bright field microscope | Leica | DM 2500M | |
Ultrasonicator | Ultrawave Ltd. | U95 | |
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results | Microsoft | Excel | |
Reagent | |||
2-propanol | Sigma-Aldrich | 34863 | FLAMMABLE |
Microscope Sildes, Clear, Ground | Thermo Fisher Scientific | 451000 | |
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated | Gelest | VDT-731 | |
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane | Gelest | SIT7900.0 | |
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution | Sigma-Aldrich | 479527 | HARMFUL, TOXIC |
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated | Gelest | HMS-301 | |
Weigh Boat 100 mL | Scientific Laboratory Supplies | BALI828 | |
Pasteur pipette | Appleton Woods | KS230 | |
Petri dish | SARSTEDT | 82.1473 | |
Razor blade | Thermo Fisher Scientific | ST10-031T | |
Adhesive Carbon Tape | Agar scientific | AGG3939 | |
16-Mercaptohexadecanoic acid | Sigma-Aldrich | 448303-1G | HARMFUL, TOXIC |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | FLAMMABLE |
Gold coated microscope slide | Sigma-Aldrich | 643203 | Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | HARMFUL, TOXIC |
Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 529303 | HARMFUL, TOXIC |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84415 | HARMFUL, TOXIC |
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 675105 | HARMFUL, TOXIC |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Cobalt(II) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 203106 | HARMFUL, TOXIC |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza UK | PT-3001 | |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza UK | PT-2501 | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
CELLSTAR Centrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | P/0840/53 | HARMFUL, TOXIC |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | "Detergent" in manuscript |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Rabbit anti-fibronectin antibody | Abcam | ab2413 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | R37117 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
12-well plate | Thermo Fisher Scientific | 10253041 | |
T75 tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10790113 | |
cantilever | BudgetSensor | ContAl-G |