En Vivo Transferencia génica en el endotelio de la arteria carótida común conejo

Summary

Este método consiste en introducir un transgen en el endotelio de las arterias carótidas de conejo. Introducción del transgén permite la evaluación de la función biológica del producto transgen en arterias normales o modelos de la enfermedad. El método también es útil para medir actividad de secuencias reguladoras del ADN.

Abstract

El objetivo de este método es introducir un transgen en el endotelio de segmentos aislados de ambas arterias carótidas comunes del conejo. El método logra focal transgénesis endotelial selectiva, lo que permite a un investigador determinar los roles biológicos de endoteliales expresan transgenes y cuantificar la actividad transcripcional in vivo de secuencias de ADN en arterias grandes células endoteliales. El método utiliza aislamiento quirúrgico de arterias carótidas comunes de conejo y una arteriotomía para entregar un vector viral expresar transgenes en la luz arterial. Un período de incubación corto del vector en el lumen, con posterior aspiración de los contenidos de la luz, es suficiente para alcanzar eficiente y duradera expresión del transgén en el endotelio, sin transducción detectable o expresión fuera de la segmento arterial aislada. El método permite la evaluación de las actividades biológicas de los productos transgénicos en arterias normales y en modelos de enfermedad vascular humana, evitando efectos sistémicos que podrían ser causados ya sea apuntando a la entrega de genes a otros sitios (por ej. el hígado) o por la alternativa de entregar construcciones genéticas al endotelio por transgénesis de línea del germen. Aplicación del método está limitada por la necesidad de un experto cirujano y anestesista, una bien equipada sala de operaciones, los costos de compra y vivienda conejos y la necesidad de experiencia en la construcción de vectores de transferencia génica y uso. Resultados obtenidos con este método incluyen: alteraciones relacionadas con el transgén en la estructura arterial, celularidad, matriz extracelular o función vasomotora; aumentos o reducciones en la inflamación arterial; alteraciones en la apoptosis de las células vasculares; y progresión, retraso o regresión de enfermedades como la hiperplasia intimal o ateroesclerosis. El método también permite la medición de la capacidad de secuencias reguladoras de ADN natural y sintético para alterar la expresión del transgén en las células endoteliales, proporcionando resultados que incluyen: niveles de transgen mRNA, los niveles de la proteína transgénica y niveles del transgén actividad enzimática.

Introduction

El objetivo de este método es introducir un transgen en el endotelio de las arterias carótidas común conejo. Introducción del transgén permite la evaluación de la función biológica del producto transgénico tanto en modelos de conejo de la humana enfermedad arterial en las arterias normales. La sobreexpresión del transgen en modelos de la enfermedad puede revelar si el transgén (y su producto de la proteína) prometen como agentes terapéuticos^1,2,3,4. Inserción de elementos reguladores cis-acting en el casete de expresión del transgén permite la evaluación de la actividad de estos elementos en el endotelio arterial en vivo^5,6. Conocimiento de la actividad de determinados elementos reguladores cis-acting puede utilizarse para diseñar casetes de expresión más activa y sondear los mecanismos de regulación génica en el endotelio de la arteria grande en vivo⁷.

Los conejos son un modelo valioso para diversos aspectos de la fisiología vascular humana y enfermedad. Los conejos comparten muchas características vasculares con los seres humanos. Por ejemplo, valores hematológicos basales, la regulación hemostática y tensión longitudinal vascular son similares entre los conejos y los seres humanos⁸. Modelos de conejo de enfermedades vasculares replican las características clave de muchas enfermedades humanas incluyendo: aneurismas (similares geométricas y características del flujo)⁹, vasoespasmo (similar respuesta a tratamiento endovascular)^10,11, y aterosclerosis (placas íntima con similares características, incluyendo un núcleo rico en lípidos, macrófagos y músculo liso células en una cubierta fibrosa)^12,13. En consecuencia, han desarrollado modelos de conejo para muchas enfermedades vasculares como trombosis, vasoespasmo, aneurisma, diabetes, estenosis de injerto vascular y ateroesclerosis^{8,13,14, 15,16}.

Para elegir entre los modelos animales de la fisiología vascular y enfermedad de los investigadores, el conejo tiene varias ventajas. En comparación con los roedores, los vasos más grandes de los conejos permiten más fácil manipulación quirúrgica, uso de dispositivos endovasculares y una mayor cantidad de tejido para mediciones cuantitativas. Los conejos son mucho más cercanos filogenéticamente a los primates que son roedores¹⁷, y la mayor diversidad genética de conejos exogámica aproxima mejor la variabilidad genética de los seres humanos. La diversidad genética es particularmente importante para los estudios preclínicos, que-por naturaleza-pretenden desarrollar terapias que pueden aplicarse a la población humana genéticamente diversa. Como con muchas si no todas las demás especies modelo, genes de conejo son fácilmente clonados o sintetizados ya se ha secuenciado el genoma de conejo con alta cobertura (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. En comparación con otros modelos animales grandes (como perros, cerdos u ovejas), los conejos son relativamente baratos de comprar y casa y son fáciles de criar y manejar. Modelos específicos de enfermedad vascular en conejos cada uno tienen sus ventajas y deficiencias como modelos de enfermedades humanas que están más allá del alcance de este manuscrito^8,12,18. Un investigador debe revisar estas ventajas y deficiencias para determinar si el conejo es el mejor modelo para contestar una pregunta experimental específica.

Introducción de secuencias reguladoras del ácido desoxirribonucleico (ADN) en células endoteliales en vivo permite la investigación de la actividad de estas secuencias en un complejo entorno fisiológico. Estudios in vitro en las células transfected endoteliales pueden ser útiles para la evaluación inicial de secuencias reguladoras del ADN; sin embargo, los niveles de expresión en modelos de cultivo de tejidos a veces se reproducen no cuando los estudios son repetidos en vivo^5,19,20. Sistemas in vitro también pueden ser útiles para explorar vías básicas de proteína de señalización y fisiología endotelial, así como comunicación entre las células vasculares cultivadas; sin embargo, más complejas vías o redes de regulación que están influenciadas por las poblaciones complejas de células vasculares vecinas o el sistema inmune se estudian mejor en un en vivo sistema^6,20. El método descrito en este documento ofrece una plataforma para explorar la regulación de la expresión de transgenes en el endotelio en el contexto de un recipiente intacto, con o sin enfermedad. En vivo el sistema también permite la investigación de interferencia celular fisiológica y patológica y la identificación de las contribuciones del sistema inmune a la regulación de la expresión de gen⁶.

Transgénesis germinal (especialmente en los ratones) es un enfoque alternativo para dirigir la expresión del transgen a las células endoteliales. Este enfoque puede proporcionar expresión del transgen durante toda la vida, con objetivos endotelial mediada por promotor específica o regiones reguladoras^21,22. Sin embargo, la generación de ratones transgénicos es costoso y desperdiciador de tiempo, varias líneas transgénicas deben probarse frecuentemente para garantizar la focalización del transgén en el tipo celular deseado y el logro de niveles de expresión del transgen adecuada y experimental resultados en sistemas murinos pueden ser dependiente de la cepa. Modelos murinos transgénicos con transgenes endotelial dirigidos tienen muchas ventajas: no es necesario realizar la cirugía en todos los animales experimentales con el fin de lograr la transgénesis, ratones experimentales pueden ser criados con numerosos otros ratones transgénicos disponibles en para probar las interacciones genéticas y fenotípicas, y hay una gran variedad de anticuerpos que reaccionan con proteínas murinas, facilitando la caracterización de fenotipos. Sin embargo, targeting de transgenes al endotelio a través de la línea germinal típicamente resulta en la expresión de transgenes a través de la vasculatura,²² lo que es difícil determinar el sitio en que está actuando el producto del transgen. Esto es especialmente cierto cuando el producto del transgen es secretado, porque un producto transgénico secretado por las células endoteliales a través de la vasculatura podría tener actividad biológica en cualquier número de sitios dentro de un animal. Aunque el método descrito en este manuscrito requiere conocimientos técnicos y servicios especializados, puede ser mucho menos tiempo y menos costosa que el desarrollo de una línea de ratón transgénico endoteliales específicos. Permite la evaluación de la función de una proteína selectivamente en las células endoteliales de un segmento de arteria grande, y permite el uso de la carótida común contralateral como control emparejado (eliminando factores sistémicos que pueden variar entre experimental animales-por ejemplo, la presión arterial o los niveles de colesterol-como variables incontroladas).

La terapia génica es un enfoque prometedor para el tratamiento de enfermedades vasculares, enfermedades crónicas especialmente, porque una sola aplicación puede ser sostenida o posiblemente toda la vida la expresión de un gene terapéutico²³. Se ha explorado la promesa terapéutica de la terapia génica en modelos animales de transferencia génica somática, a menudo el hígado^24,25, que es un objetivo relativamente fácil porque muchos vectores virales transmitidas por la sangre son hepatotrópicos. Sin embargo, para tener un efecto sobre la enfermedad vascular, la terapia génica dirigida al hígado debe alcanzar sistémica sobreexpresión de las proteínas. En general, esto requiere grandes dosis de vectores, que pueden ser tóxicas o incluso mortales²⁶. Por otra parte, aumento de los niveles sistémicos de un aumento de la proteína el riesgo de efectos secundarios fuera del objetivo, que podría complicar o incluso oscurecer la interpretación de resultados experimentales. Terapia del gene locales dirigidos a endotelio vascular como se describe en este manuscrito podría evitar efectos secundarios sistémicos porque el vector infundido no se difundió más allá del segmento arterial transduced y efectos vasculares locales pueden lograrse sin cambios en niveles plasmáticos sistémicos de la proteína. ²⁷ además, se necesita una cantidad mucho menor de vector a transducir un segmento arterial que es necesario para lograr la transducción hepática sólida. Expresión transgénica del hígado se ha divulgado a declinar con el tiempo, probablemente debido al recambio celular, que requiere dosis repetidas si la expresión transgénica de alto nivel debe ser mantenido. ²⁸ en cambio, la tasa de rotación baja del endotelio proporciona expresión estable durante al menos 48 semanas en conejos alimentados con chow y durante al menos 24 semanas en las lesiones ateroscleróticas de conejos alimentados con colesterol. ^{1 , 27}

Para determinar si este método de transferencia de genes al endotelio carótida común conejo es apropiado, las ventajas y desventajas (tabla 1) deben considerarse en el contexto de los objetivos específicos de investigación. Las ventajas de este método incluyen: exogámica los conejos son el mejor representante de la diversidad genética humana que son ratones endogámicos (importantes para el trabajo preclínico); conejos proporcionan recipientes más grandes para un manejo más fácil y más tejido para el análisis; el método puede lograr expresión transgen orientada a endotelio mucho más rápidamente de lo que hace la línea germinal endotelial en ratones transgénicos; dosis del vector se pueden ajustar fácilmente a niveles variables de modelo de expresión del transgen; procesos específicos de endotelio de arterias grandes pueden ser investigados; y transgénesis vascular local permiten la carótida opuesta en el mismo animal para ser utilizado como un control, eliminar los factores sistémicos como variables incontroladas. Desventajas incluyen: instalaciones especiales y conocimientos son necesarios; menos fondos modificados genéticamente en el que experimentar están disponibles en los conejos que en los ratones; y hay una selección menos extensa de anticuerpos de conejo frente a proteínas de ratón (para la inmunodetección de proteínas transgénicas y otros antígenos que pueden ser importantes en la interpretación de resultados experimentales).

Protocol

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por la Universidad de Washington, oficina de bienestar de animales asociado institucional Animal atención y Comité uso (IACUC) y se completaron en conformidad y cumplimiento de todos los pertinentes reglamentario e institucional directrices. Nota: Transferencia de genes a arterias carótidas comunes del conejo se realiza en conejos por un cirujano con la ayuda de un anestesiólogo o un asistente. 1. transferencia de gen arterias carótidas común conejo: a…

Representative Results

Para implementar este método con confianza, experimentos preliminares son necesarios para establecer que el operador logra a transferencia de genes eficientes y reproducibles, con expresión del transgen principalmente en las células endoteliales luminales. En nuestra experiencia, esto se calcula más fácilmente usando un vector que expresa la β-galactosidasa. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) tinción de segmentos de la carótida común quita 3 días después …

Discussion

Ciertos aspectos de la técnica quirúrgica merecen especial atención. Exposición completa y movilización de la arteria carótida común mediante disección cuidadosa voluntad de facilitar la transferencia y arteriotomía reparación de gen. Sin embargo, durante la disección, debe reducirse la manipulación directa de la arteria carótida para prevenir el vasoespasmo. Además, cualquier hemorragia adyacente a la arteria debe ser detenido mediante la aplicación de ligera presión con una gasa y sangre extravasada deb…

Materials

Disposables
3mL syringe with 24G needle	Becton Dickinson	309571	2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle	Becton Dickinson	309623	6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock	Nipro Medical Corp	JD+20L
Catheters, 24G x 3/4"	Terumo Medical Products	SROX2419V
19G needle	Becton Dickinson	305187	Gene transfer surgery only
21G needle	Becton Dickinson	305165	For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4"	Dynarex	3242	~10-15 per surgery
3-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-244
5-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-182	Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture	CP Medical	8648P	Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	421A	Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	398A	Gene transfer surgery only
Alcohol swabs	Covidien Ltd.	6818	For placement of I.V. line
Catheter plug	Vetoquinol	411498	Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL	Vedco Inc.	05098916106
Xylazine, 100 mg/mL	Akorn Inc.	4821
Lidocaine HCl, 2%	Pfizer	00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5%	Pfizer	00409161050
Beuthanasia D-Special	Intervet Inc.	NDC 00061047305	Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL	Patterson Veterinary	12496075705	Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride	Baxter	2B1309	2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL)	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10	Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr	Apotex Corp.	NDC 60505-7006-2	Gene transfer surgery only
Isoflurane	Multiple vendors	Catalog number not available
Gene transfer vector			Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight	Roboz	RS-7900	Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt	Roboz	RS-6828
Needle holder /w suture scissors	Miltex	8-14-IMC	Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors	Roboz	RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock	Roboz	RS-6412	Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt	Roboz	RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs	Roboz	RS-6514	2x
Backhaus towel clamp 3.5"	Roboz		4x
Micro clip setting forceps 4.75"	Roboz	RS-6496	Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm	Roboz		2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop	Scanlan International	1001-81M	5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width	Roboz	RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm	Roboz	RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip	Roboz	RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips	Roboz	RS-7110	2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips	Roboz	RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips	Roboz	RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips	Roboz	RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width	Roboz	RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width	Fine Science Tools	11092-12	2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight	Fine Science Tools	11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode	MACAN Manufacturing	HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump	Multiple vendors	Catalog number not available
Forced air warming unit	3M	Bair Hugger Model 505	Gene transfer surgery only
IV infusion pump	Heska	Vet IV 2.2	Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger	Multiple vendors	Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor	Surgivet	Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit	MACAN Manufacturing	MV-9
Surgical microscope	D.F. Vasconcellos	M900	Needs ~16x magnification