Målet med denne protokol er at opnå høj rentabilitet og højt udbytte af hepatocytter og sinusformet endotelceller fra leveren. Dette opnås ved perfusing lever med en type IV collagenase løsning via portalen vene, efterfulgt af differential centrifugering hepatocytter og sinusformet endotelceller.
Denne protokol viser en metode til at opnå høje afkast og levedygtighed for musen hepatocytter og sinusformet endotelceller (sek) egnet til dyrkning eller for at opnå cellelysater. I denne protokol, er Vena anvendes som webstedet for kateterisation, snarere end vena cava, da dette begrænser forurening af andre mulige celletyper i den endelige lever forberedelse. Der kræves ingen specielle instrumentation under hele proceduren. Vandbad bruges som en kilde til varme til at holde temperaturen af alle de buffere og løsninger. En standard peristaltisk pumpe bruges til at drive væsken, og en nedkølet bordplade centrifuge kræves til centrifugering procedurer. Den eneste begrænsning af denne teknik er placeringen af kateter inden for portåren, som udfordrende på nogle af mus i 18-25 g størrelsesområde. En fordel ved denne teknik er, at kun en vene er udnyttet for perfusion og adgang til vene er hurtig, som minimerer iskæmi og reperfusion i leveren, der reducerer leverens cellernes levedygtighed. En anden fordel i denne protokol er det let at skelne live fra døde hepatocytter af synet på grund af forskellen i cellulære tæthed under centrifugering trin. Celler fra denne protokol kan være brugt i cellekultur for enhver downstream ansøgning samt behandlet for nogen biokemiske vurdering.
Collagenase perfusion af leveren til at opnå hepatocytter er blevet udført siden den tidlige 1950s og er blevet løbende forbedret1,2,3,4. En meget fin gennemgang af mange metoder, teknikker og reagenser, der anvendes i levercelle renseanlæg er blevet kompileret i Meyer mfl5. At opnå et tilfredsstillende udbytte af meget levedygtig hepatocytter og SEK er teknisk udfordrende. De mekaniske kræfter, der adskiller cellerne også kvaliteten af collagenase er nogle af de variabler, der er svære at styre. På grund af hepatocyt følsomhed over for mekaniske kræfter, er deres levedygtighed markant reduceret i sub-optimale betingelser, beder behovet for en protokol, der beskriver optimale betingelser for isolation. SEK synes ikke at være så følsomme over for mekanisk klipning. In situ perfusion med collagenase fordøjelse er langt den bedste metode til at forstyrre celle-celle knudepunkter for at få enkelt celle præparater fra leveren og andre organer såsom tarmen og milt6. Denne protokol viser en simpel metode til at indføre perfusion buffer ind i vena ved hjælp af en Udtrækkelig plast kateter snarere end et snit, der kan forårsage portåren til at kollapse, som beskrevet i Smedsrød mfl7.
Målet med dette manuskript er at vise de mest kritiske trin, der kræves for succes i proceduren lever overfloden. Disse skridt omfatter kateter placering, strømmen af perfusion væsker, og håndtering af væv efter fordøjelsen. Strømningshastigheder er justeret den naturlige sats af blodgennemstrømningen, men lav nok til at holde den Glisson kapsel intakt. Når leveren er korrekt fordøjet og celler adskilles i løsning, er celle rensning relativt simple om det udføres af differential centrifugering, plade vedhæftning, eller magnetisk bead rensning. Live hepatocytter har en højere massefylde og er let renset fra nonparenchymal celler (NPC) og døde hepatocytter med langsom centrifugering. For de fleste applikationer, plade vedhæftning til at adskille Kupffer celler (KC) og SEK er en fælles metode8, selv om der er rapporter, at det ikke producerer den bedste renhed af SEK9. KCs har en tendens til at overholde faste stive overflader hurtigt og petriskåle (standard polystyren) er det mest anvendte materiale til denne procedure. SEK eller KC rensning med brug af antistof konjugeret magnetiske perler er uden tvivl den bedste metode til betydelig rensning af disse celler, selvom proceduren tilføjer en anden 3-4 h til denne protokol og det samlede afkast er nedsat9. Denne betænkning viser i detaljer processen for en optimal lever perfusion, der typisk giver en høj antallet af levedygtige celler.
Denne protokol fremhæver værktøjer der er til rådighed og det vil give brugeren en høj sats for succes i denne procedure. En vellykket perfusion er grundlæggende for enhver downstream ansøgning, når du arbejder med primærelementer.
Der er et par kritiske trin i proceduren, der bestemmer succes. Første, placering af kateter spidsen inden for portåren skal være korrekte. Hvis placeret for langt inde i leveren, perfunderet kun de mindre kamre. Spidsen bør være lige under de højre og venstre grene af portalen vene. Fordelen ved at bruge en polymer-composite kateter over en nål er, barb af nålen er mere tilbøjelige til at rive venen under perfusion end et kateter. Andet, collagenase kvalitet og kvantitet bestemme fordøjelsen effektiviteten af leveren. I denne procedure, præ-kvalificeret collagenase Type 4 blev brugt og det er genopslemmes på 0,5 mg/mL i Buffer 2 Hvis collagenase aktivitet til analyseres er større end 900 IU.
For enden af collagenase perfusion bør leveren bevare et noget mørkt tan brun farve. Hvis det er en lys tan farve, så er de fleste af hepatocytter døde. Leveren bør være falder fra hinanden når det er skåret fra musen. I de bedste betingelser, kan leveren være skovlede ud af kroppen hulrum af musen med en lille ske. Lever i denne tilstand giver altid meget høj cellernes levedygtighed. Hvis det tager mange forsøg på at ryste cellerne fra hinanden, hvis leveren er stadig fast under udvinding, eller hvis der er en masse af nødvendige kraft til at flytte hepatocytter gennem filtrene, vil derefter hepatocytter have en lavere rentabilitet. Hepatocytter er dækket med microvilli, som tillader dem at have en meget høj areal (figur 10). Ufuldstændig fordøjelse bevarer celle-celle kryds mellem hepatocytter, og mekanisk klipning vil rive plasmamembran fra hinanden. In situ perfusion med collagenase er den bedste metode til at bryde fra hinanden cellerne og opretholde høje levedygtighed. I Figur 11, blev to hepatocyt præparater er lavet i som cellen pellets sammenlignet efter et par vasker i Buffer 1. Pellet til venstre er lysere og indeholder en celle levedygtighed på omkring 50%. Pellet til højre er mørkere og har en levedygtighed på 92%. På samme måde, når væsken hældes fra de 50 mL konisk, de mørkere pellet er stille i røret, i modsætning til de lysere pellet, som vil glide i røret som væsken hældes ud. Lavere cellernes levedygtighed eller ineffektive perfusions kan opstå, når leveren har høje niveauer af sklerose.
Da levende hepatocytter har en højere vægtfylde end døde hepatocytter, vil centrifugering procedurer resultere i et præparat, der er meget ren i levedygtige hepatocytter15. Hvis der er en betydelig mængde af døde hepatocytter, (som ofte opstår, når betingelserne er suboptimal), levende kan celler være yderligere beriget og adskilt fra døde celler ved hjælp af PVP forløb. Derudover da levende hepatocytter pellet hurtigere end døde hepatocytter, øges aspiration af de top 3rd af toerstoffet også forholdet mellem levende døde celler i toerstoffet. Disse procedurer er hurtige og nemme metoder til at adskille lever fra dødt hepatocytter og celle debris når behov for10,16. Dette er især nyttigt, hvis prøven er kostbar, og kun et par millioner celler er påkrævet for eksperimentet.
Afslutningsvis, er dette en nem og effektiv metode for høst hepatocytter og SEK fra leveren. I løbende priser er omkostningerne til at udføre denne procedure, herunder alle reagenser og engangsartikler under 75 USD pr. forberedelse. Hvis flere mus er ønsket, er det bedst at fortsætte med en hepatocyt rensning og holde NPC fraktion på is, indtil alle mus der er blevet behandlet. NPCs er generelt stabilt på isen for mindst 5 h, men længere tid er ikke blevet testet i dette laboratorium.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen er fastsat i del af NIH fra grant R01HL130864.
1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
sterlized spoon | Home supply store | ||
Cotton ball(s) | Home supply store | ||
Polyester sewing thread | Home supply store | ||
Masking tape | Home supply store | ||
thumb tacks | Home supply store | ||
styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
cookie/baking sheet | Home supply store | ||
Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
Crystallizing dishes 100×50 | VWR | 89000-290 | |
Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
Reagents | |||
Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
KCl | 0.5 | 6.7 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
KCl | 0.5 | 6.71 | |
CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
HEPES | 24 | 100 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.35 | 4.7 | |
MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.2 | 2.7 | |
Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
Other reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | Gibco | 11965118 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | |||
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
LSEC medium | |||
RPMI | Gibco | 11875119 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |