התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות
Summary
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר…
Abstract
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי מקוטב מאוד הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. . זה גיליון אחד של תאי פיגמנט hexagonally ארוז, המחוברים באמצעות צמתי צר… הפונקציות העיקריות של RPE כוללים ספיגת אור, phagocytosis מקטעי החיצוני של קולט אור המחסן, אגירה המרחבי של יונים, הובלה של חומרים מזינים, יונים, מים, כמו גם מעורבות פעילה במחזור חזותי. עם כזה פונקציות חשובות ומגוונות, חשוב באורח קשה ללמוד את הביולוגיה של תאי RPE. מספר קווי תאי RPE הוקמו; עם זאת, תאים passaged מונצחים ידועים במהירות לאבד חלק מאפיינים פיזיולוגיים מורפולוגיים של תאי RPE טבעי. לפיכך, ראשי תאים מתאימים יותר ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של התא RPE ותפקוד. תרבית תאים RPE העיקרי של העכבר הוא שימושי מאוד עבור חוקרים מאז מודלים העכבר נמצאים בשימוש נרחב במחקרים ביולוגיים, אולם איסוף RPE תאים מן העכבר גם מאתגר מאוד בשל גודלם הקטן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת תרביות תאים RPE העכבר הראשי הכוללת העקירה, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. שיטה זו מאפשרת שחזור היעילה תא. תאי RPE המתקבל שני עכברים יכולים להגיע confluency על אחד הוספה ממברנה פוליאסטר של 12 מ מ, טעון מראש בצלחת תרבות לאחר שבוע של תרבות להציג חלק מהמאפיינים המקוריים של RPE בתום תאים כגון צורת משושה, פיגמנטציה לאחר שני שבועות של תרבות.
Introduction
אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) היא שכבה אחת של תאי אפיתל מקוטב הממוקם בין עצבי הרשתית דמית העין. הפונקציונליות של תאי RPE ויושר טפט RPE הם קריטיים עבור חזון כי RPE ממלא תפקיד חשוב בתהליכים מרובים כגון שמירה על המחסום דם-רשתית החיצוני, הובלת מים, יונים בין הרשתית ו מקלעת דמית העין, אור הקליטה, הגנה מפני סטרס חמצוני, שליטה על חילוף החומרים retinoid, phagocytosis המקטעים החיצוני של1,photoreceptors2. המיקום של RPE מאחורי העין, וכן תפקידה מחסום מניעת סמים מנוהל מערכתית עובר מהדם אל נוזל, להקשות ללמוד את המורכבות של ה RPE פונקציה ויוו. לפיכך, יש צורך גדול להקמתה של תרביות תאים RPE ללמוד תאי RPE גמיש, בסביבה מבוקרת3,4.
מספר קווי תאי RPE הוקמה קיימות, מתן דרך קלה ונוחה של קבלת ואחסון של התאים; עם זאת, תאים passaged יש כמה חסרונות לעומת תאים ראשי-2,–3,–4. ראשית, הם לעיתים קרובות מאופיינים על ידי שינויים מורפולוגיה תאים. לדוגמה, אף אחד ממחקרי התא הקיימים נמצאו בהכשרת מחקר אמין של המאפיינים מכשול RPE בשל האובדן של פנוטיפ קוטביות תא והעלמות חלקית של צמתי צר4. בנוסף אובדן קוטביות והתקשרויות לתא המתאים, הקווים תאי RPE לאבד במהירות שלהם פיגמנטציה בשל היעדרם של אנזימים melanogenesis מפתח ב RPE למבוגרים5. ניתן לשחזר את הפיגמנטציה, אבל ניתוח מקיף של המנגנון של פיגמנטציה מחדש אשר כוללים שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, ג’ין ביטוי מבחני ניתוח וכימיקלים לאשר הנוכחות של מלנין מעולם כבר בביצוע6. מגבלה אחת יותר הוא הקווים תאי RPE חיי תאים המורחבת (לפעמים – אלמוות), בתנאים מסוימים יכול להפוך עצמי המתחדש תאי גזע multipotent כי ניתוק מן המצע טופס צף מושבות7, 8. מגבלה זו עושה את זה בלתי אפשרי להשתמש הקווים תא עבור השתלת ניסויים3.
בהתחשב החסרונות של הקווים תאי RPE הוקמה העיקרי תרביות תאים RPE המתקבל רקמות טרי עשוי לשמש מודל יותר ביולוגית רלוונטית ללמוד את RPE. ראשי תאי RPE שימשו לא רק ללמוד פונקציות ייחודיות RPE כגון ויטמין A חילוף החומרים9, phagocytosis של קולט אור מקטעי החיצוני10 ויון תחבורה11, אלא גם ללמוד ביולוגיה של התא בסיסיים כגון אפיתל התא קוטביות2 , הומאוסטזיס lysosomal autophagy12,13.
בחודשיים האחרונים של שנים היו מספר פרסומים על ביסוס ראשוני RPE תרבויות, המציין עניין הולך וגובר באזור זה של מחקר3,14,15. פרוטוקולים רבים עבור תאי RPE אדם ותאים RPE אנושיות כגון תאי RPE שור וחזירי היו שפורסמו16,17,18,19. עם זאת, קשה יותר להתמודד עם תאי RPE העכבר בשל גודלם קטן בהרבה. אף-על-פי מספר פרסומים תיארו פרוטוקולים בידוד תאי RPE העכבר14,20,21, עדיין ישנם חוקרים רבים נאבקים לבודד תאי RPE ללא זיהום של תאים דמית העין או תאים מפני פסולת עצבי הרשתית. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול להקמת העכבר הראשי RPE תרבית תאים, לרבות קבלת העיניים של העכבר, דיסקציה של העיניים ובידוד של הסדינים RPE להניב את התאים עבור culturing. פרוטוקול וידאו זה יהיה שימושי במיוחד עבור חוקרים שמתחילים לעבוד עם העכבר הראשי RPE תרבויות, צריכים הדרכה על הטכניקות לנתיחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול מפורט הציג מאפשרת הקמת אמין של העכבר הראשי תרבויות RPE להגיע confluency לאחר שבוע 1, להציג את מאפייני RPE העיקריים כגון צורת משושה פיגמנטציה לאחר 2 שבועות. תאי RPE שהושג יכול לשמש עבור מספר יישומים במורד הזרם כגון חילוף החומרים ויטמין A9, phagocytosis של מקטעי החיצוני קולט אור<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן BrightFocus (ל- DS).
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
Riferimenti
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
