Primære cellekulturer fra mus retinale Pigment epitel
Summary
Den retinale pigment epitel (ÅV) er et multi-funktionelle epitel af øjet. Her præsenterer vi en protokol for at oprette primære cellekulturer stammer fra den murine ÅV.
Abstract
Den retinale pigment epitel (ÅV) er en meget polariseret multi-funktionelle epitel, der ligger mellem neurale nethinden og årehinden i øjet. Det er et enkelt ark af pigmenterede celler, der er hexagonalt pakket og forbundet med stramme vejkryds. De vigtigste funktioner af ÅV omfatter absorption af lys, fagocytose af skur fotoreceptor ydre segmenter, rumlige buffering af ioner, transport af næringsstoffer, ioner og vand samt aktiv deltagelse i den visuelle cyklus. Med sådanne vigtige og forskelligartede funktioner er det afgørende vigtigt at studere biologi af ÅV celler. En række af ÅV cellelinjer har opstillet; dog er passaged og udødeliggjort celler kendt for at hurtigt miste nogle af de morfologiske og fysiologiske egenskaber af naturlige ÅV celler. Således, primærelementer er mere velegnede til at studere forskellige aspekter af ÅV cellebiologi og funktion. Musen primære ÅV cellekultur er meget nyttigt for forskere, da musemodeller er meget udbredt i biologiske undersøgelser, men indsamling ÅV celler fra musen er også meget udfordrende på grund af deres lille størrelse. Vi præsenterer her, en protokol til oprettelse af primære mus ÅV cellekulturer, der omfatter enucleation og dissektion af øjnene og isolation af ÅV ark til at give celler til dyrkning. Denne metode giver mulighed for effektiv celle opsving. ÅV celler fremstillet af to mus kan nå confluency på en 12 mm polyester membran Indsæt præinstalleret i kultur plade efter en uge af kultur og vise nogle af de oprindelige egenskaber af bona fide ÅV celler som sekskantet form og pigmentering efter to uger af kultur.
Introduction
Den retinale pigment epitel (ÅV) er en enkelt lag af polariseret epitelceller, der ligger mellem neurale nethinden og årehinden i øjet. Funktionaliteten af ÅV celler og integriteten af ÅV-éncellelag er afgørende for vision, fordi ÅV spiller en stor rolle i flere processer såsom opretholde den ydre blod-retinal barriere, transport af vand og ioner mellem nethinden og de plexus, lys absorption, beskyttelse mod oxidativ stress, kontrol af retinoid metabolisme og fagocytose af de ydre dele af fotoreceptorer1,2. Placeringen af ÅV bagest i øjet, såvel som dens barriere funktion forhindrer medicin administreres systemisk i at passere fra blodet til vitreum, gør det vanskeligt at studere kompleksiteten af ÅV funktion i vivo. Således er der et stort behov for etablering af ÅV cellekulturer at studere ÅV celler i en fleksibel, kontrolleret miljø3,4.
Findes en række etablerede ÅV cellelinjer, giver en nem og bekvem måde ved udtagning og opbevaring af celler; passaged celler har dog nogle ulemper i forhold til primærelementer2,3,4. Først, de er ofte karakteriseret ved ændringer i celle morfologi. For eksempel, fandtes ingen af de eksisterende cellelinjer for at være egnet til en pålidelig undersøgelse af ÅV barriereegenskaber på grund af tabet af celle polaritet fænotype og delvis forsvinden af stramme kryds4. Ud over tab af polaritet og ordentlig celle til celle forbindelser miste ÅV cellelinjer hurtigt deres pigmentering på grund af fravær af de centrale melanogenesis enzymer i voksen ÅV5. Pigmentering kan gendannes, men den omfattende analyse af mekanismen for fornyet pigmentering, som ville omfatte en kombination af transmissions Elektron Mikroskopi, gene expression analyse og kemiske assays til at bekræfte tilstedeværelsen af melanin har aldrig været udført6. En yderligere begrænsning er at ÅV cellelinjer har udvidet celle liv (undertiden – udødelighed) og under visse betingelser kan omdanne selv fornyelse Multipotente stamceller, der løsnes fra substrat og form flydende kolonier7, 8. denne begrænsning gør det umuligt at anvende cellelinjer til transplantation eksperimenter3.
I betragtning af ulemperne ved de etablerede ÅV cellelinjer, primære ÅV cellekulturer fremstillet af frisk væv kan tjene som en mere biologisk relevante model til at studere ÅV. Primære ÅV celler har været anvendt, ikke kun at studere ÅV-specifikke funktioner, såsom vitamin A stofskifte9, fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter10 og ion transport11, men også at studere grundlæggende cellebiologi som epitelial celle polaritet2 , lysosomale homøostase, og autophagy12,13.
I de sidste par år har der været en række publikationer om oprettelse af primære ÅV kulturer, viser en stigende interesse i dette område af forskning3,14,15. Mange protokoller for ÅV menneskeceller og ikke-menneskelige ÅV celler som kvæg og svin ÅV celler blev udgivet16,17,18,19. Det er imidlertid vanskeligere at håndtere musen ÅV celler på grund af deres meget mindre størrelse. Selvom ganske en række publikationer har beskrevet protokoller for at isolere ÅV celler fra mus14,20,21, er der stadig mange forskere kæmper for at isolere ÅV celler uden forurening af plexus celler eller af celler fra neurale nethinden debris. Her præsenterer vi protokollen til oprettelse af primære mus ÅV cellekultur, herunder at få øjnene fra mus, dissektion af øjnene og isolation af ÅV ark til at give celler til dyrkning. Denne video protokollen ville være særligt nyttigt for forskere, der er begyndt at arbejde med musen primære ÅV kulturer og har brug for vejledning om dissektion teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremlagt detaljerede protokollen giver mulighed for pålidelige etablering af musen primære ÅV kulturer, der nå confluency efter 1 uge og præsentere de vigtigste ÅV karakteristika såsom sekskantet form og pigmentering efter 2 uger. De opnåede ÅV celler kan bruges til en række downstream applikationer såsom vitamin A stofskifte9, fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter10 og ion transport11, epitelcelle polaritet2, l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse var delvist finansieret af The BrightFocus Foundation (til DS).
Materials
| animals | |||
| 2~3-week old wildtype mice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Dispase II | Sigma | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F4135 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | GIBCO | 11140050 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| HEPES | Cellgro | 61-034 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| NaCl | Ambion | AM9759 | |
| L-Glutamine (200 mM) | GIBCO | 25030-081 | |
| Ethyl Alcohol | Fisher Scientific | 111000200 | |
| RPE65 antibody | A gift from Dr. Michael Redmond | ||
| Fluorescein Phalloidin | Invitrogen | F432 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Polysciences, Inc | 00380 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | 40-2200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| instruments and equipments | |||
| Laminar flow cabinet | Baker | SterilGARD SG403A | |
| Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope) | Nikon | SMZ1500 | |
| CO2 incubator with hot air sterilization | Binder | C150 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 0875712 | |
| 12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning Incorporated | COR-3460 | |
| Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp | STEPHENS instruments | S7-1320 | |
| Castroviejo suturing forceps 0.12mm | Stroz Ophthalmic Instruments | E1796 | |
| Crescent straight knife | Beaver-Visitec International | 373808 | |
| Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1×0.06 mm Tips, Dumostar | World Precision Instruments | 500233 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, 45° Angle, Standard | World Precision Instruments | 500260 | |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGL0250S | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309632 | |
| Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica | ||
| Pipette | Gilson | ||
| Barrier and non-filtered pipette tips | Thermo Scientific |
Riferimenti
- Martínez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 26, 766-777 (2004).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).
- Fronk, A. H., Vargis, E. Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations. J Tissue Eng. 7, (2016).
- Rizzolo, L. J. Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).
- Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells. Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).
- Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC). Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).
- Akrami, H., et al. Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells. J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).
- Hu, J., Bok, D. The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes. Exp Eye Res. , 46-50 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Reichhart, N., Strauss, O. Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium. Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).
- Valapala, M., et al. Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/βA3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling. Autophagy. 10, 480-496 (2014).
- Shang, P., et al. The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling. Aging Cell. , (2017).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).
- Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation. Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).
- Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique. Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Exp Eye Res. , 74-85 (2014).
- Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).
- Pitkänen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).
- Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).
