सेल झिल्ली की मरंमत परख एक दो फोटॉन लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग
Summary
कोशिका झिल्ली दो फोटॉन लेजर के माध्यम से घायल झिल्ली को सील करने की क्षमता का आकलन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है और कई सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है । यहां, हम के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो dysferlinopathy रोगी कोशिकाओं में दो फोटॉन लेजर पृथक के बाद पुनः सील झिल्ली की लाइव-इमेजिंग ।
Abstract
कई pathophysiological अपमान कोशिका झिल्ली को नुकसान का कारण बन सकता है और, जब कोशिका झिल्ली की मरंमत या अखंडता में सहज दोषों के साथ युग्मित, रोग में परिणाम कर सकते हैं । अंतर्निहित आणविक कोशिका झिल्ली की मरंमत आसपास के तंत्र को समझना है, इसलिए, एक महत्वपूर्ण उद्देश्य रोग कोशिका झिल्ली गतिशीलता के साथ जुड़े रोगों के लिए उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए । कई विट्रो में और vivo अध्ययनों में कोशिका झिल्ली को समझने के उद्देश्य से विभिन्न रोग संदर्भों में पुनर्सील दो प्रयोगात्मक उपचार के बाद कार्यात्मक परिणामों का निर्धारण करने के लिए एक मानक के रूप में फोटॉन लेजर पृथक का उपयोग. इस परख में, कोशिका झिल्ली एक दो फोटॉन लेजर, जो कोशिका झिल्ली टूटना और फ्लोरोसेंट डाई सेल घुसपैठ करने के लिए कारण बनता है के साथ घायल करने के लिए अधीन हैं । कोशिका के भीतर प्रतिदीप्ति की तीव्रता तो कोशिका की क्षमता को फिर से सील करने की निगरानी की जा सकती है. चोट करने के लिए सेल झिल्ली प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए कई वैकल्पिक तरीके हैं, के रूप में अच्छी तरह से दो में महान भिन्नता-फोटॉन लेजर अपने दृष्टिकोण को घायल कर रहे हैं, इसलिए, सेल के एक एकल, एकीकृत मॉडल को कम करने के लिए लाभप्रद सेवा करेंगे घायल इन पद्धतियों के बीच भिंनता । इस अनुच्छेद में, हम दोनों स्वस्थ और dysferlinopathy रोगी fibroblast कोशिकाओं के साथ या एक पूर्ण लंबाई dysferlin प्लाज्मिड के बिना transfected में इन विट्रो में कोशिका झिल्ली की मरंमत का आकलन करने के लिए एक सरल दो फोटॉन लेजर घायल प्रोटोकॉल रूपरेखा ।
Introduction
युकेरियोटिक कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली में प्रोटीन जड़ित फॉस्फोलिपिड की दोहरी परत होती है जो कोशिका के इंट्रा/extracellular वातावरण को परिभाषित करती है और सेलुलर homeostasis और सेल अस्तित्व को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । कोशिका झिल्ली यांत्रिक या रासायनिक अपमान से उत्पंन चोटों के कंकाल और हृदय की मांसपेशी, पेट सहित विभिंन स्तनधारी कोशिका प्रकार में आम हैं, और फेफड़ों की कोशिकाओं को1,2,3,4। दैनिक शारीरिक समारोह के फलस्वरूप चोटों के अलावा, कोशिका झिल्ली भी पर्यावरण अपमान से क्षतिग्रस्त हो सकता है, बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों, और कोरोनरी reperfusion5. कोशिका झिल्ली में टूटना करने के लिए विफलता extracellular Ca के एक अनियमित आमद की ओर जाता है2 +-अंय संभावित विषाक्त extracellular घटकों के साथ-कक्ष में, बहाव संकेत झरने जो जल्दी सेल में परिणाम कर सकते है ट्रिगर ृ1,4,5,6.
तिथि करने के लिए, वहां कोशिकाओं में झिल्ली की मरंमत के लिए कई प्रस्तावित मॉडल किया गया है । अलग मरंमत तंत्र झिल्ली टूटना के आकार और प्रकृति के आधार पर सक्रिय किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह सुझाव दिया है कि कोशिका झिल्ली पार्श्व प्रवाह या प्रोटीन कॉलेस्ट्रॉल का उपयोग करने के लिए छोटे व्यवधानों की मरंमत कर सकते है (& #60; 1 एनएम) । पार्श्व संलयन मॉडल का प्रस्ताव है कि झिल्ली टूटना तेजी से dysferlin-युक्त झिल्ली के पार्श्व भर्ती के माध्यम से सुधार कर रहे है7, जबकि प्रोटीन कॉलेस्ट्रॉल मॉडल पता चलता है कि छोटे छिद्रों प्रोटीन एकत्रीकरण के माध्यम से सुधार कर रहे है (ज्यादातर annexins) 8. इसके विपरीत, बड़ी झिल्ली घावों Ca2 +-निर्भर, dysferlin-मध्यस्थता पुटिका फ्यूजन और एक मरंमत पैच के गठन को ट्रिगर । मरंमत पैच मॉडल में, एक तेजी से Ca के सेल में2 + आमद एकाधिक प्रोटीन (dysferlin, annexins, mitsugumin-५३, और एध प्रोटीन) जो एक जटिल या “पैच” फार्म, intracellular के एक संलयन के साथ साथ की भर्ती चलाता है बुलबुले या झिल्ली क्षति के स्थल पर lysosomes4,9,10,11,12। यह ध्यान दें कि इन मॉडलों जरूरी पारस्परिक रूप से अनंय नहीं है और संगीत कार्यक्रम में काम करने के लिए झिल्ली की मरंमत की सुविधा हो सकती है महत्वपूर्ण है । ठीक से सील कोशिका झिल्ली क्षति करने के लिए विफलता पेशी dystrophy सहित कई रोग राज्यों के साथ जुड़ा हुआ है (dysferlinopathy-सहित Miyoshi मायोपथी, अंग-करधनी पेशी dystrophy प्रकार IIB, और पूर्वकाल मायोपथी शुरुआत के साथ बाहर का टिबियल) 13, cardiomyopathy14, और Chediak-हिगाशी सिंड्रोम (CHS)15.
यह देखते हुए कि उचित कोशिका झिल्ली अखंडता और फिर से सील स्वास्थ्य और रोग, कोशिका झिल्ली की मरंमत के अंतर्निहित आणविक तंत्र की गहरी समझ में इस तरह के एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए खोज में लाभप्रद होगा । इसलिए, कैनेटीक्स की निगरानी और कोशिका झिल्ली की मरंमत की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उचित प्रयोगात्मक तकनीक के अधिकारी के लिए आवश्यक है । कई विट्रो में मॉडलिंग झिल्ली की मरंमत के लिए तरीके डिजाइन किया गया है । एक रणनीति यांत्रिक चोट है, जो सेल के माध्यम से एक पिपेट/सर्जिकल ब्लेड/रेजर के साथ स्क्रैप या कोशिकाओं पर कांच मोती रोलिंग द्वारा सुविधा दी जा सकती है16। हालांकि, यांत्रिक चोट के इस प्रकार के बड़े घावों उत्पन्न करता है, और कोशिका की चोट में भिन्नता के एक उच्च डिग्री बनाता है, दोनों के भीतर और संस्कृतियों के बीच.
झिल्ली घाव पैदा करने की एक और विधि लेजर पृथक द्वारा दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी है । पारंपरिक लेजर फोकल माइक्रोस्कोपी के विपरीत है कि एकल फोटॉन उत्तेजना को रोजगार, दो फोटॉन लेजर एक साथ दो लंबी तरंग दैर्ध्य, कम ऊर्जा फोटॉनों का उपयोग करता है एक उच्च ऊर्जा इलेक्ट्रॉन के उत्तेजना की सुविधा17। इस गैर रेखीय प्रक्रिया उत्तेजना में विशेष रूप से फोकल विमान के भीतर और पूरे प्रकाश पथ17 (चित्रा 1) के साथ नहीं परिणाम । यह कम उत्तेजना मात्रा जब इमेजिंग लाइव सेल18,19धूप को कम करने में मदद करता है । शोधकर्ताओं इसलिए सेल झिल्ली में सटीक घावों को उत्पन्न करने और फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके और सेल झिल्ली टूटना के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन देख रही है और फिर फिर से सील कर के रूप में एक वास्तविक समय में फिर से सील झिल्ली की निगरानी कर रहे हैं ।
इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया गया है बार- इन विट्रो में और vivo में और एकाधिक सेल प्रकार20,21में घाव झिल्ली का अध्ययन । उदाहरण के लिए, fibroblasts और dysferlinopathy रोगियों से व्युत्पंन myotubes में झिल्ली की मरंमत दोष इस तकनीक का उपयोग कर22,23मूल्यांकन किया गया । इसके अलावा, एक मांसपेशी चूहों से अलग फाइबर मरंमत पैच गठन13,24,25की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया । फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के आंदोलन भी झिल्ली की मरंमत के दौरान एक मांसपेशी फाइबर9में देखा जा सकता है । इसके अलावा, दो-फोटॉन लेजर zebrafish भ्रूण में घायल sarcolemmal मरंमत की प्रक्रिया vivo26में वास्तविक समय में मनाया जा सकता है ।
इस अनुच्छेद में, हम fibroblasts में सेल झिल्ली की मरंमत की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक पद्धति रूपरेखा दो फोटॉन लेजर घायल का उपयोग कर, हालांकि इस पद्धति प्लाज्मा झिल्ली को सील करने की क्षमता को बढ़ाता है के प्रयोजन के लिए विभिंन प्रकार के सेल के लिए लागू किया जा सकता इन विट्रो में। इस विधि में, कोशिकाओं FM4-64 के साथ, एक lipophilic, कोशिका-अभेद्य डाई जो जल्दी fluoresces के रूप में यह झिल्ली घाव के माध्यम से सेल में प्रवेश करने पर फॉस्फोलिपिड के भीतर नकारात्मक कोशिका चार्ज करने के लिए बाइंड कर रहे हैं (चित्रा 2& #38; 3). ठहराव झिल्ली घाव से सटे डाई प्रतिदीप्ति की निगरानी के लिए समय है कि यह सेल झिल्ली के लिए खुद को फिर से सील करने के लिए लेता है की अनुमति देता है । इस विधि की उपयोगिता को उदाहरण करने के लिए, हम कोशिका झिल्ली की मरम्मत के बचाव का आकलन करने के लिए GFP-संयुग्मित पूर्ण लंबाई dysferlin (DYSF) plasmids के साथ dysferlinopathy रोगी fibroblasts transfected का उपयोग करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
कोशिका झिल्ली के घायल दो-फोटॉन लेजर एक सटीक और बहुमुखी तकनीक है झिल्ली की गतिशीलता को फिर से सील इन विट्रो मेंका आकलन करने के लिए । इस अनुच्छेद में, हम सेल झिल्ली dysferlinopathy रोगी कोशिकाओं में दो फोटॉन लेज?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चिकित्सा और दंत चिकित्सा के अलबर्टा विश्वविद्यालय के संकाय द्वारा समर्थित किया गया था, गैरेट कमिंग रिसर्च चेयर फंड के दोस्तों, एचएम Toupin स्नायविक विज्ञान अनुसंधान कुर्सी कोष, पेशी Dystrophy कनाडा, अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI), अलबर्टा उंनत शिक्षा और प्रौद्योगिकी (AET), कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), यिशै यात्रा-जीन और सेल थेरेपी, महिला और बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (WCHRI) के लिए फाउंडेशन, और अलबर्टा स्वास्थ्य समाधान नया (AIHS ).
हम पूरी लंबाई dysferlin प्लाज्मिड के साथ हमें की आपूर्ति के लिए डॉ स्टीवन लवल शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी डॉ Katsuya मियाके तकनीकी सलाह के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
Riferimenti
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
