세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

Summary

두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

수많은 pathophysiological 모욕 세포 막에 손상을 줄 수 있다 그리고, 세포 막 복구 또는 무결성, 타고 난 결점과 결합 될 때 질병 귀 착될 수 있다. 세포 막 복구를 둘러싼 근본적인 분자 메커니즘 이해은, 그러므로, 세포 막 기능 장애 역학과 관련 된 질병에 대 한 새로운 치료 전략의 개발에 중요 한 목표. 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 이해 하는 다양 한 질병 상황에서 세포 막 resealing 겨냥 실험적 치료를 수행 하는 기능 결과 결정 하기 위한 표준으로 2 광자 레이저 절제를 사용 합니다. 이 분석 결과, 세포 막 세포 막 파열 및 형광 염료는 세포에 침투 하면 2 광자 레이저로 부상 대상이 됩니다. 셀 내에 형광의 강도 다음 자체를 봉인 하는 셀의 능력 척도를 모니터링할 수 있습니다. 세포 막 응답 부상, 뿐만 아니라 접근 자체를 부상 2 광자 레이저에 큰 변화를 평가 하기 위한 여러 다른 방법이 있다, 그러므로, 셀 부상의 통합 모델 것 군인이 감소 하는 이러한 방법론 사이 변화. 이 문서에서는, 우리는 간단한 2 광자 레이저 부상 세포 막 수리에서 생체 외에서 둘 다 건강에 고 dysferlinopathy 환자 fibroblast 세포 페 전체 길이 dysferlin 플라스 미드의 유무에 관계 없이 평가 하기 위한 프로토콜 개요.

Introduction

더블-레이어 인지질 단백질에 박 혀의 셀의 내부/세포 외 환경 정의 하 고 세포질 항상성 및 세포 생존을 유지 하기 위한 필수적 이다 진 핵 세포의 세포 막에 의하여 이루어져 있다. 세포 막 상해 기계적 또는 화학 모욕에서 발생 하는 다양 한 포유류 세포 유형에서 평범, 등 골격과 심장 근육, 위, 및 폐 세포^1,2,,34. 매일 생리 기능에 따른 부상, 뿐만 아니라 세포 막도 환경 모욕, 세균 독 소, 그리고 허 혈 성 reperfusion⁵에 의해 손상 될 수 있습니다. 세포 막에 있는 파열을 봉인에 실패 리드의 extracellular 캘리포니아^{2 +}-다른 잠재적으로 유독한 세포 외 구성 요소-함께 관계가 없는 유입에 셀에 셀에 신속 하 게 발생할 수 있습니다 다운스트림 신호 폭포를 트리거링 죽음^1,4,,56.

날짜 하려면, 셀에 막 복구에 대 한 몇 가지 제안 된 모델 되었습니다. 다른 복구 메커니즘은 막 파열의 자연과 크기에 따라 활성화 될 수 있습니다. 예, 그것은 측면 흐름 또는 작은 중단 복구 막는 단백질 세포 막 사용할 수 제안 (< 1 nm). 측면 퓨전 모델 제안 막 파열 포함 하는 dysferlin의 측면 모집을 통해 급속 하 게 고치는 막⁷, 모델을 막는 단백질 단백질 집계를 통해 작은 구멍 고치는 제안 하는 동안 (주로 annexins) ⁸. 반대로, 큰 막 병 변을 일으킬 캘리포니아^{2 +}-의존, dysferlin 중재 소포 융해 및 수리 패치의 형성. 수리 패치 모델에서 셀으로 빠른 Ca^{2 +} 유입 트리거 복잡 한 또는 “패치”, 융합 함께 세포내 vesicles의 형성 하는 여러 단백질 (dysferlin, annexins, mitsugumin-53, 및 EDH 단백질)의 채용 또는 막의 사이트에서 리소좀 손상^4,,910,,1112. 그것은이 모델 반드시 상호 배타적이 고 막 수리를 촉진 하기 위하여 연주회에서 작동 수 있습니다 해야 합니다. 세포 막 손상 제대로 봉인에 실패는 근이 영양 증 (dysferlinopathy-미요시 myopathy, 등 다리 띠 근이 영양 증 유형 IIB, 전방 tibial 발병 원심 myopathy)를 포함 하 여 여러 질병 상태와 관련 ¹³,¹⁴, 심근 그리고 Chediak-히가시 증후군 (CHS)¹⁵.

그 적절 한 세포 막의 무결성 및 놀이 resealing 건강과 질병에 중요 한 역할 세포 막 복구의 기본 분자 메커니즘에 대 한 깊은 이해 것에 도움이 될 새로운 치료 전략에 대 한 검색. 그것은, 그러므로, 활동을 모니터링 하 고 세포 막 수리 능력 평가를 적절 한 실험 기법을 보유 하는 데 필요한입니다. 막 복구를 모델링 하기 위한 여러 가지 생체 외에서 방법은 설계 되었습니다. 한 전략 셀 된다고 피 펫/외과 블레이드/면도기를 사용 하거나 셀¹⁶유리 구슬 롤링을 통해 촉진 될 수 있는 기계적 상해를 포함 한다. 그러나, 기계적 상해의이 유형은 더 큰 병 변, 생성 하 고 셀 부상, 내와 문화 사이에서 변이의 고차를 만듭니다.

막 상처를 생성 하는 또 다른 방법은 두 광자 현미경 검사 법에 의해 레이저 절제입니다. 전통적인 레이저 confocal 현미경 검사 법 단일 광자 여기를 고용 하 고, 달리 2 광자 레이저는 동시에 고 에너지 전자¹⁷의 흥분을 촉진 하기 위하여 두 긴 파장, 저 에너지 광자를 사용 합니다. 이 아닌-선형 프로세스 여기 초점 평면 내에서 독점적으로 그리고 전체 빛 경로¹⁷ (그림 1) 따라 하지 발생합니다. 이 때 라이브 셀^18,19이미징 photodamage를 최소화 하기 위해 여기 볼륨 수 감소. 연구원은 따라서 정확한 병 변 세포 막 및 모니터 막 resealing 실시간으로 세포 막 파열 그리고 reseals로 형광 강도 변화를 관찰 하 고 형광 염료를 사용 하 여 생성할 수 있습니다.

이 이렇게는 반복적으로 막 부상 생체 외에서 그리고 vivo에서 공부 하는 데 사용 되었습니다 그리고 여러 셀에^20,21종류. 예를 들어 막 섬유 아 세포 및 환자가 기술을^22,23을 사용 하 여 평가 했다 dysferlinopathy에서 파생 된 myotubes 결함을 복구 합니다. 또한, 마우스에서 분리 한 근육 섬유 수리 패치 형성^13,,2425를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 붙일 태그가 단백질의 움직임 또한 단일 근육 섬유⁹막 수리 하는 동안 관찰할 수 있습니다. 또한, sarcolemmal 수리 2 광자 레이저 zebrafish 태아에 부상 다음 과정 실시간 vivo에서²⁶에 관찰할 수 있습니다.

이 문서에서는, 우리는이 방법론은 원형질 막 resealing 능력 측정을 위해 다양 한 셀 형식에 적용 될 수 있지만 두 광자 레이저 부상를 사용 하 여 섬유 아 세포의 세포 막 수리 역학을 평가 하기 위한 방법론 개요 생체 외에서. 이 방법에서는, 세포는 인 큐베이 팅 FM4-64, 신속 하 게 그것을 부정적으로 결속으로 fluoresces 닥터지, 셀 스며들 지 않는 염료 충전 막 병 변 통해 셀 입력 시 세포질 내에서 인지질 (그림 2& 3). 염료 형광 막 병 변에 인접 한의 정량화 세포 막 자체를 봉인 하는 데 걸리는 시간을 모니터링 하기 위한 수 있습니다. 이 방법의 유틸리티를 예증 하 사용 dysferlinopathy 환자 fibroblasts GFP 활용 전체 길이 dysferlin (DYSF) 플라스 미드와 페 세포 막 복구의 구조를 평가 합니다.

Protocol

이 연구에 사용 된 인간 섬유 아 세포 세포는의 학부와 앨버타의 대학에 치과의 인간의 윤리 위원회에서 승인 된 사용 되었다. 1. 전체 길이 DYSF 플라스 미드를 가진 세포의 transfection 문화 fibroblast 세포 성장 미디어-36 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS)의 4 mL와 20 µ L의 페니실린/스 (P/S)-37 ° c.에 CO2 배양 기에서의 40 mL를 포함 하는 T225 플라스 ?…

Representative Results

건강 한 인간의 섬유 아 세포, 비 치료 dysferlinopathy 환자의 섬유 아 세포 및 환자 fibroblasts 전체 길이 dysferlin 시퀀스 2 광자 레이저 부상 능력 resealing 막 평가 대상이 됐다을 포함 하는 플라스 미드와 페 진짜 시간에서. 건강 한 인간의 fibroblast 세포 표시 레이저 부상 다음 FM 4-64 형광 활성화의 낮은 수준 및 비 치료 환자 fibroblasts 전시 상대 형광 강도 상해 다음의 높은 수준의 …

Discussion

세포 막의 2 광자 레이저 부상 resealing 에 체 외막의 역학을 평가 하기 위한 정확 하 고 다양 한 기술입니다. 이 문서에서는, 우리 세포 막 resealing 분석 결과 부상 2 광자 레이저를 사용 하 여 dysferlinopathy 환자 세포 능력을 결정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 결과 보여 dysferlinopathy 환자 세포는 세포 막 resealing, 결함이 있는 다른 연구자에 의해 연구 결과와 일치 하는 있는 추가 근?…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media	Thermo Fisher	31985070
Transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Dye	Invitrogen	T13320
Tyrode’s Salts Solution	Sigma-Aldrich	T2397
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	NA
Chameleon Two-photon laser	Coherent	NA